? в столбики сахарного агара по методу Вейнберга.
Инкубация 18-24 часа при 37єС.
3 этап
Учет результатов на питательныхпо признакам:
Культуральным в зависимости от возбудителя (бело-серые круглые колонии на КСА и рост в виде пушинок, комочков ваты или округлыхзерен на СА).
Обнаружение грамположительных палочек в мазках, окрашенных по Граму.
Наличие гемолиза.
Пересев подозрительных колоний в среду Китта-Тароцци.
Инкубация 18-24 часа при 37єС.
4 этап
Идентификация чистой культуры следующим признакам:
Обнаружение грамположительных палочек в мазках, окрашенных по Граму.
Биохимические свойства -сахаролитические и протеолитические (в зависимости от возбудителя).
Заражение белых мышей исследуемым материалом или фильтратом бульонной идентификации токсина (токсигенности) помощью реакции нейтрализации.
Ускоренная диагностика:
РИФ, ПЦР, ИФА.
Посев материала в прогретую среду Китта-Тароцци, Вильсона-Блера и в молоко. Инкубация в термостате 5-6 часов при 37єС.
В результате: в ср. Китта-Тароцци - помутнение и газообразование, в ср Вильсона-Блера - почернение среды, в молоке - створаживание.
Лабораторная диагностика возбудителей анаэробных инфекций
Материал для исследования:
· возбудитель столбняка-кусочки пораженных тканей, экссудат, перевязочный материал, инородное тело, выделения из пупочного канатика.
· возбудитель ботулизма-промывные воды желудка, испражнения, моча, рвотные массы, остатки пищи.
· возбудитель газовой гангрены -кусочки пораженный тканей, отечная жидкость, перевязочный материал, почва, испражнения, продукты.
Бактериоскопический метод
Из исследуемого материала делают мазок, окашивают по Граму, обнаруживают Грам+ палочки.
Если материал был взят из внешней среды, то применяют окраску по Цилю-Нильсену (выявление спор: возбудитель столбняка - круглые, реже овальные, терминальные, напоминают «барабанные палочки;
возбудитель ботулизма - располагаются субтерминально, вид теннисной ракетки;
возбудитель газовой гангрены - споры овальные, располагаются чаще центрально). Для выявления С. perfringensмазок окрашивают по Бурри-Гинсу(выявление капсул).
Бактериологический метод (основной)
Изначально делают посев материала на прогретую на водяной бане в течение 30 минут при 85єС (чтобы растворить кислород и убрать вегетативные форы сопутствующей микрофлоры) среду Китта-Тароцци, заливают маслом, повторно кипятят и инкубируют от 20 минут до 3-5 часов.
Китта-Тароцци (помутнение, газообразование, возможно растворение кусочков паренхиматозных органов).
Делаем пересев на какую-нибудь плотную среду:
-- Вильсона-Блера (почернение среды, колонии в виде «маковых зерен»),
-- Цейсслера -- кровяно-сахарный агар (сероватые колонии в виде «паучков», окруженные зоной гемолиза),
--Высокий столбик сахарного агара (S-форма - в виде зерен чечевицы, R-форма -- в виде пушинок),
--Железосульфитный агар.
Получаем выросшую культуру. Затем выделяем чистую культуры, накапливаем на среде Китта-Тароцци. Чистая культура выделяется и накапливается на жидкой питательной среде, потому что среду Китта-Тароццци можно профильтровать и процентрифугировать. Полученный осадок используют для микроскопии. Надосадочную жидкость - для постановки реакции нейтрализации на белых мышах.
Реакция нейтрализации:
Одной мышке вводим порцию надосадочной жидкости в нативном состоянии, второй мышке вводим часть надосадочной жидкости, смешанной со специфической анатотоксическойсывороткой, предварительно выдержанной в термостате в течение 30-60 минут. Первая мышка обязательно погибает, так как ей ввели экзотоксин, вторая мышка выживает, потому что мы ввели ей экзотоксин,смешанныйсо специфической анатотоксической сывороткой, и произошла реакция нейтрализации. Особенно широко применяется для выявления ботулизма, а именно для выявлениятипаботулотоксина: одной мышке вводят часть надосадочной жидкости, смешанной с антисывороткой типа А, второй -смешанной сантисывороткой типа В, третьей смешанной с антисывороткойтипа Е, четвертой только нативнуюнадосадочную жидкость. Последняя мышка точно погибнет, из других может кто-то выживет.