**Число эксплантов - относительное число эксплантов, получаемых из одного растения.
К примеру, верхушечные почки обычно обладают более высоким потенциалом в сравнении с боковыми. Чем выше побег, из которого взят эксплант на дереве, тем менее вероятность образования на нем корней.
Важную роль играет размер экспланта, определяя стартовый запас питательных веществ, в т.ч. эндогенных фитогормонов. Чем крупнее эксплант, тем, естественно, такой запас больше. Индуцировать рост небольшого числа клеток всегда труднее. Однако с увеличением размера экспланта возрастает и вероятность его инфицирования поверхностной и/ или внутренней инфекцией, поэтому обычно при выборе размера экспланта достигают компромисса между этими разнонаправленными факторами. Влияет также на эффективность регенерации и площадь раневой поверхности и расположение экспланта на среде. При аполярном расположении экспланта (верхушкой побега вниз) регенерация побегов и корней происходит лучше чем при полярном (верхушкой побега вверх).
Физические и химические факторы. Среди физических факторов, влияющих на регенерацию, наиболее важны температура, освещенность, содержание кислорода в культуральной системе. Например, при культивировании ткани моркови уменьшение содержания кислорода приводит к образованию стеблевых почек, а его увеличение - к образованию корней. На примере культуры топинамбура выявлено, что при действии голубым светом индуцируется побегообразование, а освещение красным светом вызывает корнеобразование (Першина, 2000).
Среди химических факторов главным является состав питательной среды, в особенности соотношение фитогормонов. В классической работе Скуга и Миллера (1957) установлено, что баланс цитокининов и ауксинов определяет направление морфогенеза (правило Скуга, Миллера):
1) Превышение концентрации цитокинина над ауксином в каллусной культуре приводит к образованию стеблевых почек и побегов
2)Увеличение концентрации ауксина приводит к развитию корней.
3)Среднее, близкое к равному соотношению этих фитогормонов поддерживает неорганизованный рост каллусной ткани.
9.2 Органогенез
Формирование придаточных побегов in vitro происходит чаще и лучше поддается контролю, чем развитие соматических зародышей из культивируемых эксплантов. Существуют три способа получения растений через органогенез:
1. Путем формирования придаточных органов на каллусе, полученном из экспланта.
2. Путем формирования придаточных органов прямо из экспланта, минуя фазу каллусообразования.
3. Путем формирования растений-регенерантов из побегов, образовавшихся из верхушечных или пазушных почек.
Для получения морфогенного каллуса используют различные экспланты (у травянистых растений- стебли, листья, лепестки цветков; у древесных растений- верхушки побегов). Обязательным условием образования каллуса является добавление в агаризованную среду ауксина (чаще 2,4Д). Добавление цитокининов облегчает рост каллуса. Для органогенного каллуса характерно появление меристематически активных отдельных клеток или групп клеток (предшественников побегов и корней), находящихся в основном в базальной части каллуса, контактирующей с питательной средой. Клетки меристематических зон характеризуются интенсивным синтезом РНК и белка и становятся источником формирующих зачатки органов.
Органогенез стимулируется путем пересадки каллуса на новую среду с измененным гормональным балансом (снижается концентрация ауксинов, повышается концентрация цитокининов), что сопровождается появлением и ростом побегов. Для укоренения также побеги переносят на среду, содержащую ауксины.
Прямой органогенез (минуя стадию каллуса) возможен у травянистых растений при использовании в качестве эксплантов листьев, луковиц, клубнелуковиц, стеблей, корневищ и клубней. Эксплант помещают на питательную среду, содержащую небольшое количество ауксинов и цитокининов (чтобы избежать формирования каллуса), после чего из него образуются побеги. Пучок побегов расчленяется для пересадки на свежую питательную среду.
Регенерация побегов из почек является основой для промышленного клонального микроразмножения многих видов растений.
Наличие в почках активных меристематических тканей, обеспечивающих рост верхушечных или боковых побегов, предопределяет успешную регенерацию побегов in vitro из сегмента или кончика побега с почкой или апикальной меристемы. Отсутствие стадии каллуса обеспечивает меньшую вероятность генетических отклонений у полученных регенерантов Обычно эксплант помещается на среду, содержащую ауксины и цитокинины в низких концентрациях, недостаточных для образования каллуса. Благодаря наличию в среде цитокининов снимается эффект апикального доминирования, что облегчает образование дополнительных побегов. После расчленения пучка побегов каждый из них высаживается на свежую питательную среду. Такой тип регенерации характерен для многих древесных растений (плодовые культуры, ягодные кустарники и др.). Для картофеля характерен линейный рост побегов, которые расчленяются на однопочковые черенки для пересадки на свежую среду.
9.3 Соматический эмбриогенез
Образование соматических зародышей в культуре in vitro может проходить прямым или непрямым путем. В первом случае эмбриоид образуется из клеток экспланта, минуя стадию каллуса. Такое явление характерно для цитрусовых культур, у которых ткани нуцеллуса in vivo дают начало нуцеллярным зародышам. Нуцеллярные зародыши, образовавшиеся в результате адвентивной полиэмбрионии, несут признаки только материнского растения. Образование эмбриоидов у цитрусовых может быть вызвано и в культуре in vitro после культивирования нуцеллуса на питательной среде, что может использоваться для их клонального микроразмножения.
Непрямой соматический эмбриогенез включает несколько этапов:
1. Стимуляция образования каллуса из экспланта на среде, содержащей высокие концентрации ауксина). При этом происходит дедифференциация клеток - инициалей, из которых образуются предзародыши.
2. Перенос каллуса на среду с пониженной концентрацией ауксинов либо их полным отсутствием. На этом этапе из предзародышей в результате эмбриогенеза формируются биполярные зародыши.
3. Прорастание эмбриоидов и развитие растений. Условия прорастания зависит от особенностей культивируемых видов.
Наиболее характерен непрямой соматический эмбриогенез для моркови и других представителей семейства Umbelliferae. У моркови практически любая часть растения - корень, черешок листа, цветоножка, лист, стебель или зиготический зародыш продуцирует эмбриогенный каллус. У злаков соматический эмбриогенез может быть получен при использовании в качестве экспланта щитков молодых зародышей. Соматический эмбриогенез можно использовать для получения искусственных семян, а также клонального микроразмножения растений.
Регенерация растений любым из описанных выше методов является главным звеном любой методики или технологии клеточной инженерии. Без успешной регенерации невозможны любые эксперименты по соматической гибридизации, гаплоидии, клеточной селекции, а также разработка промышленных методов клонального микроразмножения растений. Важную роль этот процесс играет и при создании трансгенных растений. (см. главу 1)
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Дайте определение культуре in vitro. На каких принципах она основана?
2. Опишите основные этапы развития клеточной инженерии.
3. Что такое эксплант? Каковы источники получения эксплантов?
4. Опишите методы стерилизации. Каковы физические условия культивирования клеток и тканей in vitro?
6. Назовите компоненты питательных сред для культивирования in vitro.
7. Что такое каллус? Назовите фазы ростового цикла каллуса и особенности каллусных клеток.
8. Как используются каллусные клетки?
9. Дайте определение суспензионных культур. Опишите методы их получения и культивирования.
10. Каковы особенности получения и культивирования протопластов растений? Для каких целей их используют?
11. Дайте определение тотипотентности растительной клетки.
12. Каковы возможные пути морфогенеза растений in vitro? Какие факторы определяют эффективность морфогенеза?
13. В чем отличие органогенеза от соматического эмбриогенеза?