Лекция: Клеточная инженерия

Растительные протопласты способны восстанавливать клеточную оболочку, в результате делений образовывать каллус и в результате регенерации формировать растения. Благодаря этой способности протопласты нашли широкое применение в биотехнологии при гибридизации соматических клеток, переносе субклеточных частиц, клеточной селекции и генетической инженерии. (Рис. 5).

Рис. 5 Клеточная инженерия на основе изолированных протопластов (Бутенко,1990).

Отсутствие клеточной оболочки облегчает проникновение в протопласт из окружающего раствора макромолекул (белки, нуклеиновые кислоты) и частиц (клеточные органеллы, микроорганизмы.).

Получение протопластов, таким образом, позволяет переходить с организменного уровня на клеточный и обратно, манипулировать содержанием растительной клетки, изменяя ее генетический аппарат.

Исходным материалом для выделения протопластов могут быть различные части растений- листья, корни, семядоли, гипокотили, пыльцевые зерна, каллусные и суспензионные культуры. Оптимальные условия для выделения протопластов индивидуальны для различных растений и типов тканей. Главными факторами являются состав ферментов, рН среды, выбор осмотического раствора, физиологическое состояние, возраст и условия выращивания исходного растения. Вероятность получения жизнеспособных протопластов увеличивается, если растения находятся в состоянии активного роста. Эксплант растения подвергается стерилизации. Ферментные растворы лучше готовить непосредственно перед опытом или за сутки до опыта. Стерилизацию ферментов раствора производят через бактериальные фильтры. Важным фактором для выделения жизнеспособных протопластов является подбор осмотического стабилизатора, в качестве которого обычно используют сахара (глюкоза, сахароза, ксилоза, сорбит, маннит); а также ионные осмотики - растворы солей СаСl₂, Na₂ HPO₄, KCl. Среда должна быть гипертоничной, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии.

Для получения протопластов из листьев их нарезают узкими полосами, после чего помещают на поверхность ферментного раствора в чашки Петри (1 г листовой ткани в 10 мл ферментного раствора). Ферментацию листьев табака или картофеля проводят при 28-30 С в течение 15-18 часов. Ферментные смеси для мезофилла табака содержат 0,5 % целлюлазы, 0,5 % мацеразы, 0,2 % дриселазы. Для мезофилла листа картофеля используют смесь 1% целлулизина, 0,5 % мацеразы и 0,2 дриселазы. Ферментные смеси растворяют в растворе, содержащем 0,5 М сахарозы и 50 мМ СаСl₂ при рН 5,5 - 5,6.

Для получения протопластов из суспензионной культуры ее предварительно осаждают центрифугированием или фильтрованием, затем переносят в ферментный раствор. Каллусные ткани, растущие на агаре, переносят в чашку с ферментным раствором с помощью скальпеля. В случае использования для получения протопластов каллуса и суспензионной культуры отпадает необходимость в стерилизации исходного материала. При использовании каллуса и суспензионной культуры лучшей является поздняя стадия логарифмического роста (клеточные стенки легче разрушаются ферментами, протопласты наиболее жизнеспособны).

После обработки ферментным раствором и изоляции протопласты должны быть очищены от остатков ткани и отмыты от ферментов. Для этого содержимое чашки после инкубации в ферментном растворе фильтруют через воронку с нейлоновым фильтром в пустую колбочку. Затем полученную суспензию изолированных протопластов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Подбирая растворы различной плотности, добиваются осаждения протопластов на дно пробирки или всплывания на поверхность раствора. Протопласты отбирают пипеткой и переносят в среду, содержащую осмотик, в которой их центрифугируют второй раз, отмывая от ферментного раствора. Отмывку обычно осуществляют дважды.

Для культивирования протопластов используют обычно метод платирования в агаре или метод жидких капель. Перед пересадкой протопласты промывают, суспендируют в определенном объеме среды для культивирования и подсчитывают количество клеток в образце с использованием камеры Фукса-Розенталя. Для определения жизнеспособности протопластов их окрашивают флуоресцеиндиацетатом (ФДА), после чего жизнеспособные протопласты узнают по зеленому свечению в ультрафиолетовом свете.

При платировании в агаре объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в чашки Петри, добавляют равный объем той же среды, содержащей 1% агар-агара. Температура не должна превышать 45 ^оС Тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для застывания агара. Плотность культивирования протопластов 10⁴-10⁵/мл. Чашки Петри запечатывают парафилмом и хранят перевернутыми в термостатируемой комнате для культивирования. Протопласты фиксируются на крышке чашки Петри, что дает возможность наблюдать развитие каждого протопласта.

При культивировании в висячей/сидячей капле протопласты с помощью автоматической пипетки распределяют по маленьким каплям (20-40 мкл) на крышке или на дне чашки Петри. Чашки запечатывают парафилмом и хранят при высокой влажности.

Для культивирования протопластов используют обычно среды Мурасиге-Скуга (1962); Нагата, Такебе (1971); Као, Михайлюка (1978). Оптимальные условия культивирования протопластов видо- и сортоспецифичны. Как правило, для инициации деления протопластов света не требуется, однако некоторые из них обладают чувствительностью к свету. Температура в зависимости от культуры колеблется от 22 до 30 ^оС.

Клеточная стенка у протопластов образуется сразу после удаления раствора фермента. Первые деления протопластов начинаются через 24-36 часов. в результате чего образуются колонии клеток (рис.6).

Рис.6 Первые деления клеток томатов, полученных из протопластов (Т.В. Манешина, Г.Г. Бричкова, 2003)

При перенесении колонии клеток на агазированную среду образуется каллус, из которого при определенных условиях культивирования формируется целые растения (рис. 7).

Рис. 7 Схема, иллюстрирующая этапы получения и культивирования протопластов из клеток растений (Смоленская, Носов, 1988)

Регенерация целых растений происходит при наличии в составе питательной среды цитокининов и ауксинов.

9. МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Реализация генетической программы клетки в культуре in vitro происходит в результате морфогенеза- заложения, роста и развития органов, тканей и клеток у растений. Соматическая клетка обладает тотипотентностью, то есть способностью полностью реализовать свою программу развития и дать начало целому растению. В процессе дифференциации клеток и тканей растения между ними возникают физиологические и структурные различия, связанные со специализацией. В организме эти процессы происходят в онтогенезе от образования зиготы до естественной смерти. В культуре in vitro морфогенез имеет свою специфику. Эта специфика связана в первую очередь с вычленением экспланта и выходом его из под контроля всего организма. Включается программа развития, приводящая к регенерации из группы клеток и тканей целого растения. Возможны и другие пути морфогенеза in vitro (образование корней-ризогенез, цветочных почек- флорогенез, каллуса - каллусогенез) (Рис. 8)

Рис. 8 Возможные пути преобразования при культивировании изолированных тканей (Першина, 2000)

Процесс регенерации в культуре in vitro может протекать по двум направлениям (рис. 9).

Рис.9 Морфологические особенности зиготических (1) и соматических (2) зародышей по сравнению со стеблевыми почками, развивающимися in vivo (3) и in vitro (4).

Соматический или неполовой эмбриогенез - образование биполярных зародышеподобных структур из соматических клеток. Такие зародыши в дальнейшем развиваются в регенеранты через стадии аналогично зиготе.

Органогенез - образование монополярной структуры, т.е. отдельных органов из меристем (корней, стеблей, реже цветков или листьев).

Эмбриогенез или органогенез может происходить непосредственно в ткани экспланта (прямой) или через стадию каллуса (непрямой).

Оба этих процесса зависят от ряда факторов, главными среди которых являются генетические особенности вида, физиологическое состояние растения и тип экспланта, химические и физические условия культивирования. Различные типы морфогенеза представлены на рисунках 10.; 11

Рис.10 Формирование ризогенного (а) и эмбриогенного (б) каллуса при культивировании листьев пшеницы T.militinae (Орлов, Сидор, 2003)

Рисунок 11. Корнеобразование (1), каллусная ткань (2) и стеблевой органогенез (3) у томатов a -на среде MS-T, содержащей 5 мг/л БАП в сочетании с 0,2 мг/л НУК; b - на среде MS-T, содержащей два цитокинина: 5 мг/л БАП и 1,0 мг/л Зеатин (Л.А. Окулич, Т.В. Манешина, 2003).

9.1 Факторы, определяющие эффективность морфогенеза растений in vitro

Генотип растения. Существуют большие различия в морфогенетическом потенциале растений, то есть их способности регенерировать in vitro.Известно, что двудольные растения регенерируют лучше однодольных. Однолетние растения обычно регенерируют лучше многолетних. Среди двудольных растений представители отдельных семейств (Solаnaceae, Begoniaceae, Cruciferae и др.) регенерируют лучше других. Имеются различия между видами в пределах семейств, а также между сортами в пределах видов культурных растений. Эту генетическую специфику в способности к регенерации растений необходимо учитывать при разработке технологии клеточной инженерии, в особенности при клональном микроразмножении растений.

В ряде работ установлены тип наследования и локализация генов, ответственных за регенерацию генов in vitro, что позволяет использовать отдельные генотипы с высоким морфогенетическим потенциалом как доноры этого признака в селекции (Рис. 12).

Рис. 12. Проявление эффекта гетерозиса у томата по регенерационной способности. Слево направо: Beta, линия 7, Beta х линия 7 (Никонович, Кильчевский, 1995)

Возраст и физиологическое состояние растения. Регенерационная способность молодых тканей выше в сравнении со старыми, поэтому в качестве экспланта для введения в культуру используются апикальные меристемы, верхушки побегов, зародыши, семена. В процессе культивирования in vitro тканей, полученных из взрослых растений может происходить их реювенилизация, т.е омоложение, выражающееся в повышении интенсивности деления клеток и способности к регенерации.. Физиологическое состояние растений во многом зависит от времени года и условий культивирования. Растения, находящиеся в состоянии активного роста, предпочтительнее как источник эксплантов растения в состоянии глубокого покоя. Этот фактор особенно важен для двулетних и многолетних растений, которые впадают в состояние покоя осенью и зимой. Эти сроки взятия эксплантов для таких растений малоэффективны. Важным фактором успешной регенерации является длительность культивирования тканей. С увеличением продолжительности культивирования тканей утрачивается их способность к регенерации стеблевых и цветочных почек. Дольше сохраняется способность к ризогенезу - образованию корней. Состояние здоровья растения также влияет на его морфогенетический потенциал (здоровые растения предпочтительнее больных). Физиологический статус растения определяет его гормональный баланс: концентрацию и соотношение в тканях эксплантов стимуляторов (ауксины, цитокинины, гиббереллины) и ингибиторов (этилен, абсцизовая кислота). В свою очередь физиологическое состояние растения зависит от условий культивирования, и экзогенного воздействия регуляторами роста. К примеру, стрессовые условия (засуха, пониженные или повышенные температуры, недостаток света) могут влиять на физиологический статус растения и гормональный баланс. Обычно растения, выращенные в теплице (более вытянутые и этиолированные) лучше регенерируют в сравнении с растениями, выращенными в открытом грунте. Существуют методы предобработки растения перед взятием эксплантов для изменения его физиологического состояния (обработки материнских растений цитокининами, гиббереллином и др.)

Тип и размер экспланта. Практически любая часть растения может служить в качестве экспланта, однако оптимальный тип экспланта для регенерации in vitro зависит от вида растения и определяется экспериментально(Рис. 13; 14)

Рис.13 Регенерация растений пшеницы T. dicoccoides из эмбриогенного каллуса листового происхождения. Сверху - ранняя стадия регенерации (Орлов, Сидор, 2003)

Рис. 14. регенерация растений ячменя H. geniculatum из эмбриогенного каллуса листового происхождения (сверху - ранняя стадия) (Орлов, Сидор, 2003)

Тип экспланта и его расположение на растении определяют морфогенетический потенциал (Табл. 5), а также направление морфогенетических процессов.

Таблица 5

источники эксплантов покрытосеменных растений и их относительный морфогенетический потенциал (Б. Тиссера, 1989)

*Морфологический потенциал используется для описания способности экспланта регенерировать растения in vitro.