Лекция: Клеточная инженерия

Использование каллуса для микроразмножения растений. Культуры, могут размножаться в результате образования зародышеподобных структур (эмбриоидов) из каллуса или суспензионной культуры, полученной на его основе. Недостаток этого метода вегетативного размножения - возможность появления генетических отклонений в результате сомаклональной изменчивости.

Получение вторичных метаболитов. Культура каллуса и суспензионная культура применяется для промышленного получения синтезируемых клетками соединений, используемых для целей медицины, защиты растений, производства продуктов питания и др.

5. СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

Суспензии растительных клеток представляют собой одиночные клетки и их агрегаты, которые растут в жидкой аэрируемой питательной среде во взвешенном состоянии. Для обеспечения аэрации в жидкой среде необходимо постоянное перемешивание или встряхивание, что можно обеспечить следующими способами:

Культура суспензионных клеток выращивается в колбах в жидкой питательной среде на качалках ротационного или шейкерного типа или роллерах (накопительное культивирование);

Выращивание суспензионной культуры в жидкой питательной среде в ферментерах при подаче воздуха в сочетании с механическим перемешиванием (непрерывное культивирование).

Обычно суспензионную культуру получают путем переноса кусочков рыхлого каллуса в перемешиваемую жидкую питательную среду того же состава, что и среда, на которой выращивался каллус, но без агара. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2-3 г каллусной ткани на 60-100 мл питательной среды. Первичную суспензию получают на круговой качалке при скорости вращения 100-120 об/ мин.

Успех получения суспензионной культуры из каллуса обеспечивается использованием рыхлых каллусов, полученных с применением 2,4 Д, исключением из среды ионов Са²⁺, обработкой ферментом пектиназой транспланта, предназначенного для выращивания в суспензионной культуре.

Возможно также получение суспензионной культуры из мезофильных клеток листьев путем обработки специальной средой для мацерации клеток, содержащей фермент мацеразу (Диксон,1989). Таким образом можно получать суспензионные культуры томата и табака.

Рост клеточной популяции в суспензии при накопительном культивировании выражается S- образной кривой и включает те же этапы, что и при росте каллуса. Обычно накопительные суспензии культивируют до стационарной фазы роста, что составляет длительность пассажа 21-28 дней. При этом суспензия включает не только одиночные клетки, но и их агрегаты (группа клеток), число которых зависит от условий культивирования (Рис.3).

Рис. 3. Число отдельных клеток и различных агрегатов суспензионной культуры мака при выращивании в колбах (а) и в ферментере (б) (Тухбатулина, Шамина, 1986, цит. по Бутенко 1990)

Клетки суспензионной культуры так же, как и клетки каллуса, находятся в дедифференцированном состоянии и нуждаются для деления в наличии в составе питательной среды ауксинов и цитокининов. Суспензионная культура имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных тканей поверхностным способом на твердых средах. Здесь легче влиять на клеточный метаболизм, в связи с чем суспензионные культуры часто используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов. Важным их преимуществом при выделении ферментов или продуктов вторичного метаболизма является отсутствие у большинства суспензионных культур хлорофилла и каротиноидных пигментов (Диксон, 1989).

Суспензионные культуры клеток обычно требуют регулярного и более частого субкультивирования, чем каллусные культуры, из которых они получены. Первичную суспензию в конце экспоненциальной фазы фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных агрегатов или остатков экспланта. Определенный объем суспензионной культуры переносят с помощью пипеток или шприцов на свежую питательную среду. Рост суспензионной культуры можно оценивать по следующим параметрам: объем осажденных клеток, число клеток, сырая и сухая масса, содержание белка и ДНК, жизнеспособность клеток. Объем осажденных клеток изучается при центрифугировании суспензионных культур в процентах от объема суспензии, число клеток подсчитывается в счетной камере Фукса-Розенталя под микроскопом после мацерации (разделения клеток) с помощью хромовой кислоты или пектиназы. Жизнеспособность клеток оценивают по их окрашиванию красителем (метиленовая синь или синь Эванса). Мертвые клетки при этом окрашиваются в синий цвет. Суспензионные культуры, как и каллусные клетки, образуют линии, отличающиеся между собой генетически и физиологически. Культивирование в суспензионной культуре может приводить к увеличению сомаклональной изменчивости.

Суспензионная культура, как и каллусная используется для сохранения генетического материала при пониженных температурах, получения протопластов, использования в клеточной селекции, микроразмножения растений и получения искусственных семян, получения вторичных метоболитов.

6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КАЛЛУСА И СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

Растения издавна используются не только для производства продуктов питания, но и как источник различных химических соединений., число которых в настоящее время достигло 2. 10⁴. Среди веществ, синтезируемых растением, выделяют группу так называемых "вторичных метаболитов", то есть компонентов клетки, не являющихся необходимыми для ее выживания. К их числу относятся алкалоиды, гликозиды, стероиды, терпены, флавоноиды и другие вещества. Вторичные метаболиты нашли широкое применение в народном хозяйстве в качестве лекарственных средств, природных пестицидов, пищевых добавок, красителей и отдушек. Примеры промышленного использования некоторых вторичных метаболитов представлены в таблице 6.

Таблица.6

Промышленное использование некоторых растительных продуктов (Фаулер, 1987)

Химический и микробиологический синтез ряда химических соединений не всегда дает положительные результаты в сравнении с получением их из растительного сырья. Новые возможности для производства вторичных метаболитов открывает культивирование растительных клеток in vitro. Установлено, что в культуре клеток in vitro способность к синтезу вторичных метаболитов сохраняется. Преимущество этого способа в сравнении с традиционным получением из растительного сырья заключается в независимости от погодных условий, высоком выходе и качестве продукции, возможности организации промышленного производства. Конечным критерием в таком случае является рентабельность производства химических соединений.

Для культивирования суспензионной культуры с целью производства вторичных метаболитов используют закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. В закрытой системе при периодическом режиме выращивания, клеточная масса остается закрытой в определенном объеме среды до конца выращивания. В закрытой непрерывной культуре в систему периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки при этом остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

В открытые проточные культуры периодически (или непрерывно) поступает свежая питательная среда, однако отбирается не только старая среда, но и часть урожая клеточной массы.

Наиболее изученным и распространенным режимом культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система. В этом случае для аэрации и перемешивания используют роллеры, качалки, ферментеры, где аэрация осуществляется механическими мешалками или воздушным потоком.

Для промышленного выращивания суспензионной культуры растений служат ферменты, которые обеспечивают стерильность условий культивирования, регулирование факторов среды (температура, газовый состав, освещенность и др.) на различных этапах развития суспензионной культуры и возможность контролировать путем отбора проб продуктивность биомассы и синтез вторичных метаболитов.

Деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных метаболитов возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной фазе.

Для получения вторичных метаболитов возможно культивирование не только суспензионных клеток, но и каллуса на твердой питательной среде (например, каллуса женьшеня и других лекарственных растений). Технология производства биомассы женьшеня из каллуса освоена на Бобруйском гидролизном заводе.

7. КУЛЬТУРА ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК

Культивирование одиночных клеток представляет большой интерес в связи с возможностью получения на их основе генетически однородных клонов. Важно использовать одиночные клетки (протопласты) и для соматической гибридизации. Для изолирования одиночных клеток используют рыхлый каллус, низкоагрегированную суспензию, изолирование отдельных клеток непосредственно из тканей целого растения (например, мезофилла листа после мацерации его ферментам). Используют следующие методы выращивания одиночных клеток:

Метод культуры-няньки. Одиночные клетки, изолированные стерильной петлей или микропипеткой из каллуса или суспензионной культуры, переносятся на стерильную фильтровальную бумагу, помещенную за 2-3 дня до изолирования клеток на верхушку каллусной ткани-няньки. Клетка на фильтре получает от каллуса питательные вещества в результате диффузии через фильтровальную бумагу.

Метод кормящего слоя близок к методу культуры-няньки. В качестве кормящего слоя используют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка. Другой вариант культивирования одиночных клеток на основе выделений из делящихся клеток - кондиционирование среды. В этом случае клеточную суспензию в экспоненциальной фазе фильтруют через бактериальный фильтр, после чего фильтрат (среду с выделениями клеток суспензии) добавляют в среду для культивирования одиночных клеток.

Метод микрокапель основан на асептическом культивировании одиночных клеток в капле жидкой среды, окруженной стерильным минеральным маслом в специально сконструированных микрокамерах.

Метод плейтинга - высев клеток в агаризованные среды. Суспензию одиночных клеток смешивают с расплавленной агаризованной средой, охлажденной до 35 -40⁰ С и разливают тонким слоем в стерильные чашки Петри, которые инкубируют в темноте или рассеянном свете.

Метод пластинок -реплик. На чашку, посеянную методом плейтинга, наносят капроновую сетку, чтобы она находилась в контакте с агаризованной средой. Клетки прорастают через нити сетки и прилипают к ней. Через 20 дней контакта сетку переносят на новую чашку Петри обратной стороной. При этом на новой чашке копируется расположение клеточных клонов.

8. ПРОТОПЛАСТЫ РАСТЕНИЙ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

Изолированные протопласты представляют собой клетки, лишенные оболочки. Оболочка растительных клеток состоит главным образом из целлюлозы, гемицеллюлозы и пектиновых веществ. Для ее разрушения применяют ферментативные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Впервые изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментов было осуществлено Е. Кокингом.

В настоящее время технология получения протопластов отработана для ряда культурных растений: табак, перец, баклажан, картофель, томаты, соя, клевер люцерна морковь, рапс и др. (рис.4.).

а б

Рис. 4 Протопласты табака (а) и томата (б) (Бричкова Г.Г., Богуш Н.А., Плюта А.В. Манешина Т.В., 2003)