Лекция: Клеточная инженерия

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Клеточная инженерия является одним из основных разделов биотехнологии. Под клеточной инженерией в широком смысле понимают культивирование в асептических условиях среды вне организма (in vitro) изолированных клеток и тканей растений, животных и микроорганизмов, а также различные манипуляции с ними (слияние, размножение и др.). Культура клеток и тканей растений in vitro основана на трех принципах:

1. Необходимость изолирования экспланта (клетка, кусочек ткани,орган) от материнского растения.

2. Культивирование экспланта в регулируемых условиях, определяемых химическим составом питательной среды, а также физическими условиями (интенсивность освещения, длина дня и спектральный состав света, температурный режим, влажность воздуха, газовый состав культуральных сосудов).

3. Выполнение всех работ по культивированию клеток и тканей в стерильных условиях (стерилизация экспланта, питательной среды, культуральных сосудов и др.)

История развития клеточной инженерии растений началась в 19 веке. Главные вехи на этом пути представлены в таблице 1 (по Р.Пиерик, 1987, с изменениями). клеточный инженерия каллус морфогенез

Таблица 1

Этапы развития клеточной инженерии растений (по Р.Пиерик, с изменениями)

Большой вклад в развитие клеточной инженерии внесли биотехнологи СНГ. Р.Г. Бутенко (Институт физиологии растений, Москва) создала научную школу по культуре изолированных тканей и физиологии морфогенеза растений in vitro. Ю.Ю. Глеба, В.А. Сидоров и др. (Украинский биотехнологический центр, Киев) выполнили цикл исследований по соматической гибридизации и клеточной селекции растений. Н.А.Картель и др. (Институт генетики и цитологии НАН Беларуси) изучили генентические основы процессов каллусогенеза и регенерации у растений.

С переходом на культивирование клеток биологи получили мощный инструментарий для изменения наследственности организмов, получения принципиально новых форм, разработки новых технологий в селекции, семеноводстве, защите растений, повышения плодородия почв, защите окружающей среды и др.

Кратко рассмотрим основные направления использования достижений клеточной инженерии.

1. В области селекции с переходом на клеточный уровень стало возможным вести клеточную и гаметную селекцию на устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам, преодолевать барьеры нескрещиваемости и создавать принципиально новые формы, несущие различные наборы ядерных и цитоплазматических генов в результате соматической гибридизации, изменять уровень плоидности и ускорять селекционный процесс путем использования гаплоидов, сохранять генофонд в виде культуры клеток посредством криосохранения в жидком азоте. Следует также отметить, что технологии создания трансгенных растений, как правило, включают и культивирование клеток и тканей in vitro.

2. В области семеноводства создана индустрия производства оздоровленного от вирусов и других патогенов посадочного материала вегетативно размножаемых культур (картофель, плодовые, ягодные, овощные, декоративные растения)

3. В области защиты растений получены на основе достижений генной и клеточной инженерии растения, устойчивые к насекомым, вирусам, болезням, и другим патогенам; созданы новые средства защиты растений путем культивирования бактерий и грибов (антагонистов патогенов), биологически активных веществ, полученных при культивировании организмов и т.д.

4. Путем клеточной инженерии созданы новые штаммы микроорганизмов, повышающие усвоение азота и фосфора, подавляющие развитие вредной микрофлоры, что позволяет конструировать микробоценоз, достигая повышения плодородия почвы и продуктивности растения.

Принципиально новые возможности открываются в области защиты окружающей среды. Новые штаммы микроорганизмов позволяют решить экологически безопасным путем проблему утилизации отходов промышленности и сельского хозяйства, получая при этом энергию. Этот же подход позволяет уменьшить действие поллютантов (тяжелые металлы, нефтепродукты, пестициды и др.) на экосистемы и человека.

Создание на основе генной и клеточной инженерии растений с максимальным накоплением поллютантов позволит извлекать их из загрязненного субстрата (почва, вода), а растения с минимальным накоплением дадут возможность получать экологически безопасную продукцию.

6. Культивирование новых микроорганизмов и растений-суперпродуцентов биологически активных веществ позволит более эффективно решить проблему создания и производства новых лекарств и препаратов для медицины и ветеринарии. Важным направлением практического применения клеточной инженерии является микробиологический синтез белка и незаменимых аминокислот.

Область применения достижений клеточной инженерии постоянно расширяется по мере пополнения методов культивирования клеток и тканей и различных манипуляций с ними и разработки этих подходов для новых видов растений, животных и микроорганизмов.

1. ИСТОЧНИКИ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСПЛАНТОВ

Эксплантом для введения в культуру in vitro может быть практически любая часть растения (часть стебля, листа, корня, цветка, запасающих органов, семена, пыльца). Для введения в культуру in vitro экспланта главными являются две задачи: 1) добиться инициации роста и развития клеток и тканей экспланта; 2) обеспечить стерильность в сосудах для культивации. Успех введения в культуру определяется генетическими и физиологическими особенностями материнского растения и степенью его инфицированности микроорганизмами. Растения, выращенные в фитотроне, имеют значительно меньшую степень инфицированности микроорганизмами, в сравнении с растениями из теплиц и, тем более, полевых условий (табл.2)

Таблица 2

Среднее количество микроорганизмов на цветке томата в зависимости от условий культивирования (Боурне,1977)

Для быстрого выявления инфекции на первом этапе культивирования желательно использовать питательную среду Зао или среду Мурасиге и Скуга, дополненную 250 мг/л молочного альбумина.

Конкретный выбор экспланта определяется спецификой культуры, а также целью культивирования. Экспериментальный материал, вводимый в культуру in vitro, во многом определяет эффективность культивирования. Р.Пиерик (1987) обсудил основные аспекты этого вопроса.

Генотип. Регенерационная способность растения зависит в первую очередь от генетических особенностей (семейство, вид, сорт). Так, например, двудольные растения легче образуют каллус и регенерируют, чем однодольные. Среди двудольных лучше регенерируют представители семейств Solanaceae, Begoniaceae, Grassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae. Представители некоторых семейств (например, пасленовые) традиционно служат модельными объектами для отработки методик в культуре in vitro (табак). Имеется существенная сортовая специфика протекания морфогенетических процессов in vitro, что особенно важно при разработке технологий клонального микроразмножения растений.

2. Возраст растения. Эмбриональные ткани имеют более высокую регенерационную способность. С возрастом способность растений к регенерации уменьшается, поэтому молодые растения как источник эксплантов предпочтительнее старых.

3. Физиологическое состояние. Стадия развития и физиологическое состояние материнского растения определяют способность экспланта к активной пролиферации in vitro. Растения, вступившие в генеративную фазу; обычно снижают регенерационный потенциал в сравнении с находящимися в вегетативной фазе. Почки, взятые с растения, находящегося в состоянии покоя (поздняя осень или ранняя зима) труднее регенерируют в сравнении с почками, взятыми весной. Выведение органа, из которого вычленяется эксплант, из состояния покоя изменяет соотношения эндогенных регуляторов, повышая концентрацию стимуляторов (ауксины, цитокинины, гиббереллины) и уменьшая концентрацию ингибиторов (этилен, абсцизовая кислота). В связи с этим в некоторых случаях прибегают к предобработке материнского растения перед вычленения экспланта химическими (регуляторы роста) или физическими факторами (холодовая обработка и др) для изменения физиологического состояния и инициации ростовых процессов. На рост in vitro влияет также «состояние здоровья» растения. Угнетенные растения со слабыми ростовыми процессами менее эффективны. Условия при культивировании материнского растения изменяют его физиологическое состояние, способствуя накоплению запасных веществ и регуляторов роста и влияя на рост in vitro. Так, например, растения из теплиц (более вытянутые и этиолированые) обычно регенерируют лучше растений этого вида из открытого грунта.

4. Расположение экспланта на растении. У растений имеется так называемый градиент регенерации. Каждое растение отличается различной эффективностью регенерационных процессов из разных органов. Так, для лилии лучшими эксплантами являются луковичные чешуи. Листья и стебли не дают положительного результата (Французенок,1997).

Размер экспланта и метод инокуляции. Большие по размеру экспланты снабжены большим запасом питательных веществ, что положительно влияет на эффективность регенерации. Однако большие размеры экспланта могут повышать и вероятность инфицирования в культуре in vitro. На эффективность регенерации влияет также площадь раневой поверхности.В некоторых случаях она специально увеличивается для активизации образования каллуса.

Экспланты могут помещаться на среду полярно (основание к среде) и аполярно (основание выше среды, верхушка в среде). В ряде работ показано, что аполярное размещение способствует более быстрой регенерации корней и побегов.

2. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Стерильность является одним из основопологающих принципов культивирования клеток и тканей растений in vitro, поскольку питательная среда - отличный субстрат для развития микроорганизмов. Все манипуляции с культурой in vitro выполняются в ламинар-боксе, который подвергается стерилизации ультрафиолетом в течении 30 минут с последующим протиранием рабочих поверхностей 70%-ным спиртом.

Посуду, завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизуют сухим паром в сушильном шкафу при температуре160⁰ С в течение двух часов или влажным жаром в автоклаве при 2 атмосферах в течение25-30 минут.

Стерилизацию экспланта проводят следующими агентами: 0,1% сулема; 0,1%диацид; 1% бром,3-6%-ный хлорамин, 5-10% гипохлорит (кальция,натрия), 10-12 % перекись водорода Концентрация и длительность экспозиции зависят от вида растения, экспланта и стерилизующего агента (см. табл. 2.3).Органы, используемые для получения экспланта моют щеткой с мылом, затем промывают дистиллированной водой и опускают на несколько секунд в 70%-ный этанол (семена на 1-2 минуты).После обработки основным стерилизующим агентом органы тщательно промываются стерильной водой для удаления антисептика.

Таблица 3.

Стерилизация исходного растительного материала (Р.Г.Бутенко, 1990)