Лекция: Клеточная инженерия

Для стерилизации питательных сред используют автоклавирование при температуре 120 ⁰ С и давлении 1 атмосфера в течение 20 минут. Термолабильные компоненты, разрушающиеся при автоклавировании, подвергают холодной стерилизации. Для этой цели используются бактериальные фильтры. Профильтрованные растворы смешиваются в ламинар-боксах с автоклавированной средой, охлажденной до 40 ⁰С.

3. УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОРГАНОВ, ТКАНЕЙ, КЛЕТОК И ПРОТОПЛАСТОВ НА ИСКУССТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Рост и развитие растений in vitro определяется их генетическими особенностями, физиологическим состоянием, а также химическими и физическими условиями культивирования. Химические условия связаны с составом питательной среды для культивирования, физические условия - свет, температура, рН, содержание О_2,, СО₂ и других газов.

Важным моментом культивирования является выбор культуральных сосудов. Обычно они выполняются из стекла или пластика. Стекло имеет преимущество в связи с возможностью автоклавирования и длительностью использования. Пластик не всегда можно автоклавировать. В ряде случаев пластик одноразового пользования упаковывается в стерильные пакеты. В качестве стеклянных сосудов могут быть пробирки, чашки Петри, колбы Эрленмейера и специальные сосуды с крышками, устойчивыми к автоклавированию. Пробирки и колбы могут закрываться ватно-марлевыми пробками, фольгой или специальной пленкой. Если пластик не автоклавируется, он подвергается стерилизации гамма-лучами. В такие сосуды простерилизованная питательная среда разливается в ламинар-боксах.

В больших сосудах культура in vitro растет лучше, чем в маленьких, что связано с увеличением объема воздуха и среды на одно растение, снижением концентрации токсичных газов (СО_2, этилен и др).

3.1 Основные принципы составления питательных сред

Компоненты среды

Вода. Питательные среды представляют собой водные растворы различной концентрации, поэтому качество воды играет большую роль. Для практических и исследовательских целей используют дистиллированную воду, для работы с протопластами и меристемами применяют двойной дистиллят

Агар-агар.Твердая консистенция питательной среды определяется наличием в ней агар-агара - полисахарида, получаемого из морских водорослей. Оптимальная концентрация агара - 0,6-0,8 %. Возможно культивирование клеток и тканей на жидкой питательной среде или на заменителях агара (синтетические полимеры, минеральная вата, мостики из фильтрованной бумаги и др). Один из вариантов культивирования - двухфазная среда. В этом случае на твердую питательную среду высаживается эксплант, а затем добавляется жидкая среда.

Углеводы. Растительные клетки и ткани в культуре in vitro питаются преимущественно гетеротрофно, поскольку процесс фотосинтеза в этих условиях затруднен или невозможен (если культивирование происходит в темноте). Наиболее часто источником углеводов является сахароза в концентрации 1-5%, возможно также применение глюкозы и фруктозы.

Макро- и микроэлементы. Обязательными компонентами среды для роста и развития растения in vitro являются макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера, железо) и микроэлементы (медь, цинк, марганец, бор, молибден, кобальт). Для улучшения поступления железа в растительные клетки в состав питательной среды добавляется этилендиаминтетроуксусная кислота ЭДТА или ее натриевая соль. Наиболее распространенной и часто применяемой является среда Т. Мурасиге и Ф. Скуга (1962), которая хорошо сбалансирована по основным элементам питания. Эта среда отличается высоким содержанием ионов (93 ммол/л) и считается богатой средой, в то время, как среда Кнопа содержит только 23 ммол/л и относится к бедным. Некоторые культуры не выносят высокой концентрации солей отдельных элементов (например хлора) и их соотношений. В этом случае необходимо подбирать специальные среды с оптимальным для культуры составом макро-и микроэлементов. Обычно среды называют по имени их создателей: Среды Мурасиге-Скуга, Гамборга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Хеллера, Кнопа и др (Табл. 4).

Таблица 4

Состав некоторых питательных сред, применяемых при культивировании тканей растений

Примечание: Среда Као и Михайлюка содержит дополнительно (мг/л): фруктозы, рибозы, ксилозы, маннозы, рамнозы, целлобиозы, сорбита -- по 125; маннита, никотинамида, аскорбиновой кислоты--по 1; витамина А-- 10; витамина D₃--0,5; Са-пантотената -- 0,01; витамина В ₁₂-- 0,2; п-аминобензойной кислоты -- 0,01; биотина -- 0,005; холинхлорида -- 0,5; рибофлавина -- 0,1; 2,4-Д -- 0,2; зеатина -- 0,5; НУК--1; гидролизата казеина -- 125; кокосового молока -- 10; CaCI₂ (30 %) -- 1,5; глюкозы -- 68 400; пирувата Na -- 5; лимонной, яблочной и фумаровой кислоты -- по 10.

* Состав экзогенных гормональных препаратов варьирует в зависимости от объектов.

В ряде случаев используют не полную концентрацию солей, а ее часть (1/4-1/2). К примеру, высокая концентрация солей может задерживать образование корней в культуре in vitro, что приводит к необходимости уменьшения концентрации.

рН среды. Оптимальная рН среды для большинства культур колеблется в пределах 0- 6, Чаще всего используют рН 5,5-5,6. При низкой (меньше 4,5) и высокой (больше 7,0) рН рост и развитие in vitro останавливается. Концентрация водородных ионов в культуре in vitro влияет на устойчивость индолилуксусной кислоты, гиббереллина, витамина В₁ и пантотеновой кислоты, желатинизацию агара, поступление в растение фосфатов, аммония, железа (Бутенко,1968). Корректировка рН производится добавлением в среду растворов щелочи Na OH или кислоты НСl (0,1- 1,0 М).

Витамины. В состав питательных сред могут входить следующие витамины: мезоинозит, витамин В₁ (тиамин), пантотеновая кислота, фолиевая кислота (витамин М), рибофлавин (витамин В₂), аскорбиновая кислота (витамин С), никотиновая кислота (витамин РР), пиридоксин (витамин В₆), биотин (витамин Н), пара-аминобензойная кислота, токоферол (витамин Е). Концентрация витамина С в некоторых случаях повышается в связи с его антиоксидантной активностью (например, если эксплант при культивировании выделяет токсичные метаболиты).

Регуляторы роста. Для роста культуры клеток и тканей растений in vitro необходимо наличие в составе питательной среды природных или синтетических гормонов. Их концентрация и взаимодействие обусловливают направление и скорость процессов морфогенеза (образование каллуса, корней, побегов и др.). К наиболее часто употребляемым регуляторам относятся ауксины и цитокинины. Могут использоваться также гиббереллины, этилен и абсцизовая кислота, а также недавно открытые брассиностероиды.

Ауксины. К ауксинам относятся индолил-3-уксусная кислота (ИУК), - нафтилуксусная кислота (НУК), индолилмасляная кислота (ИМК), 2,4- дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4 -Д). Степень активности ауксинов возрастает от ИУК к 2,4 -Д. Используют их в концентрации от 0,01 до 10 мг/л. Ауксины вызывают дедифференцировку клеток, растяжение клеточной оболочки, деление клеток и образование каллуса, образование корней, ингибируют образование боковых побегов. При низких концентрациях ауксины образуют корни, при высоких преобладает образование каллуса. 2,4-Д как самый активный ауксин (в 30 раз активнее ИУК) вызывает образование каллуса, но может индуцировать мутации.

Цитокинины. Среди цитокининов используются аденин, кинетин, 6- бензиламинопурин (6- БАП), зеатин, 6-, - диметилаллиаминопурин (2 иП). Они применяются в концентрациях от 1 до 10 мг/л и индуцируют процесс деления клеток, образования боковых побегов, подавляя при этом развитие корней. Цитокинины задерживают старение тканей in vitro.

Гиббереллины не являются обязательными компонентами питательных сред. Наиболее часто применяют гибберелловую кислоту (ГА₃). Гиббереллины способствуют удлинению междоузлий, а также росту меристем и почек in vitro. Кроме того, они выводят из состояния покоя изолированные зародыши и семена. Гиббереллины могут ингибировать образование придаточных побегов и корней.

Другие регуляторы. Использование других регуляторов достаточно редко и обычно связано со специальными или исследовательскими целями. Абсцизовая кислота может способствовать образованию микроклубней картофеля in vitro. Гормон газообразной природы этилен может накапливаться в культуральных сосудах в результате выделения тканями растений. При этом возможно ингибирование ростовых процессов in vitro. Этилен влияет на процесс органогенеза, например усиливает образование луковичек у лилий in vitro. Есть сведения и о положительном действии этилена на индукцию клеточного деления. Брассиностероиды могут способствовать образованию каллуса.

Взаимодействие фитогормонов in vitro. При подборе видов и концентраций фитогормонов in vitro необходимо учитывать следующие обстоятельства.

1. Каждая морфогенетическая реакция происходит при определенной концентрации фитогормонов.

2. Действие экзогенных фитогормонов зависит от генотипа, стадии органогенеза, наличия эндогенных фитогормонов и физических условий.

3. Любая морфогенетическая реакция обусловлена балансом фитогормонов. Согласно правилу Скуга, Миллера образование побегов стимулируется при преобладании в среде цитокининов по отношению к ауксинам, преобладание ауксинов вызывает образование корней. Антагонизм может наблюдаться при взаимном действии стимуляторов и ингибиторов на любую морфогенетическую реакцию (образование корней, побегов, каллуса и др). Возможен и синергизм (совместное положительное действие фитогормонов). Примером может служить стимулирующее действие ауксинов и цитокининов на процесс деления клеток и рост тканей.

Другие компоненты среды. В отдельных случаях в состав питательной среды могут добавляться кокосовое молоко, солодовый и дрожжевой экстракт, томатный и апельсиновый сок, гидролизат казеина, пептон. В питательную среду может добавляться также активированный уголь, который обладает способностью адсорбировать токсические темноокрашенные пигменты и другие метаболиты, угнетающие рост растения in vitro. Добавление активированного угля в среду способствует развитию и органогенезу древесных растений.

Приготовление и хранение питательных сред. Растворы макро- и микроэлементов готовят более концентрированными (макросоли- в 10-20 раз, микросоли- в 100-1000 раз и витамины - в 1000 раз). Маточные растворы хранят в холодильнике, причем витамины - при отрицательной температуре. Регуляторы роста также используют в виде маточных растворов.

Приготовленные среды желательно хранить в холодильнике в темноте при температуре 5 ⁰ С. На свету может происходить потеря активности некоторых фитогормонов (ИУК, кинетин).

3.2 Физические условия культивирования

Для создания оптимальных физических условий при культивировании клеток и тканей in vitro используют культуральные комнаты или климокамеры. При культивировании в отдельных случаях свет не нужен (каллусные ткани и др.), что позволяет использовать термостат. Обычно в культуральных комнатах устанавливают стеллажи, на которых монтируют люминесцентные лампы. Культуральные комнаты снабжаются системой автоматизации для регуляции температуры и длины светового дня, влажности и аэрации.

Свет. При выборе светового режима необходимо учитывать три фактора: длину дня, интенсивность освещенности и спектральный состав света. Оптимальная длина дня зависит от биологии культуры. Наиболее часто используют длину дня 14-16 часов. В отдельных случаях длину дня сокращают. Например, для индукции образования микроклубней картофеля длину дня можно уменьшить до 8 часов или поместить пробирки с растениями в условия пониженной освещенности. Оптимальная интенсивность света зависит от особенностей культуры и фазы онтогенеза и колеблется от 1 до 10 тысяч люкс. Для большинства культур оптимальной является освещенность 4-6 тысяч люкс, однако для прохождения отдельных этапов онтогенеза растения нуждаются в пониженной освещенности. К примеру образование луковичек in vitro у лилий происходит при освещенности 1-3 тысяч люкс (Французенок, 1997). Реже регулируется спектральный состав, который определяется типом ламп. Однако иногда это необходимо. Так, рядом авторов установлено, что красный свет способствует образованию придаточных побегов и корней. А.П. Ермишиным (1998) было установлено, что при подсветке растений картофеля - доноров пыльников дуговыми ртутными лампами (ДРИ-2000- 6) существенно повышается частота образования каллуса в культуре пыльников, т.е. спектральный состав света играл ключевую роль в этом процессе.

Температура. Оптимальная температура для большинства культур in vitro составляет 24-26 ⁰ С и определяется биологией культуры и фазой онтогенеза. Для тропических культур оптимальна более высокая температура (28-29 ⁰ С). Для растений умеренного климата оптимум температуры может быть до 18-20 ⁰ С. Низкие температуры могут использоваться также для выведения из состояния покоя, прорастания семян и др. Так, для выведения из состояния покоя образованных in vitro луковичек гладиолусов и лилий необходима температура 5⁰ С в течение 4-6 недель (Пиерик,1967). Низкая температура используется также для остановки роста культур in vitro.