го числа больных с кумаринорезистентностью с изучением фармакокинетики варфарина у этих пациентов.
Однако изменения в гене VKORС1 могут приводить не только к повышению, но и к понижению подобранных доз варфарина. D’Andrea и соавт. (2005) изучали влияние более распространенного полиморфного маркера C1173Т гена VKORC1 на режим дозирования варфарина у 147 пациентов[11]. Полиморфный маркер С1173Т представлен заменой в нуклеотидной последовательности гена VKORC1 цитозина на тимин в 1173-м положении (в интроне 1), что приводит к снижению экспрессии. Оказалось, что у пациентов с генотипом СС подобранная доза варфарина составляла 6,2 мг/сут, у пациентов с СТ генотипом ‒ 4,8 мг/сут, у пациентов с ТТ генотипом ‒ 3,5 мг/сут, при этом различия оказались статистически значимыми [11,12]. Аналогичные данные были получены Н.Р. Reitsma и соавт. (2006) у пациентов, применяющих другие непрямые антикоагулянты: аценокумарол и фенпрокумон [12].
Rieder исоавт. (2005) из10 заменвпромоторнойзонегенаVKORC1 выделили пять главных гаплотипов, которые определяли подобранную дозу варфарина [7]. Авторы разделили эти гаплотипы на две группы: низких доз варфарина (группа А, включающая гаплотипы Н1 и Н2) и высоких доз варфарина (группа В, включающая гаплотипы Н7, Н8 и Н9). Так, у пациентов с генотипом АА подобранная доза варфарина составила 2,7±0,2 мг/сут, у пациентов с генотипом АВ - 4,9±0,2 мг/сут, упациентовсгенотипомВВ‒6,2±0,3 мг/сут(р<0,001). Авторы показали, что у пациентов с генотипом АА происходит снижение экспрессии гена VKORC1. При этом наблюдали снижение содержания VKORC1 в гепатоцитах, что может объяснить применение более низких доз варфарина, необходимых для данной категории пациентов. У пациентов с генотипом ВВ наблюдали обратную ситуацию: повышение экспрессии гена VKORC1 приводило к более высокому содержанию VKORC1 в гепатоцитах, и, следовательно, этим пациентам требовалась более высокая доза варфарина [8].
Н.Y. Yuan и соавт. (2005) изучали влияние носительства генотипов по полиморфному маркеру G-1639А (в промоторной зоне) гена VKORC1 на фармакодинамику варфарина у 104 больных, принимающих данный препарат для профилактики тромбоэмболических
26
осложнений [12]. Оказалось, что генотип АА ассоциировался с высокой чувствительностью к варфарину, в то время как генотип GG ‒ с низкой чувствительностью к данному препарату, т.е. с кумаринорезистентностью. У китайцев этот генотип распространен с частотой 0 ‒ 2,7%, в то время как у европеоидов ‒ с частотой 39% [2]. I. Воdin
исоавт. (2005) также показали, что у здоровых добровольцев с генотипом АА по полиморфному маркеру G-1639А после однократного приемадругогонепрямогоантикоагулянтааценокумаролаактивность VII фактора свертывания снизилась более чем на 37%, а МНО увеличилосьболеечемна30%, чегонепроисходилоулицсгенотипамиАG
иGG [43]. Недавно С.L. Аquilante и соавт. (2006) провели изучение влияния носительства генотипов по новому полиморфному маркеру G3673А гена VKORC1 на недельные дозы варфарина у 350 пациентов. Оказалось, что недельная доза варфарина у пациентов с генотипом АА была достоверно ниже по сравнению с лицами с генотипами АG и GG (23,1±7 по сравнению с 32,9±11, р<0,0001 и 23,1±7 по срав-
нению с 45.6±17, р<0.0001 соответственно) [2].
По данным всероссийского многоцентрового рандомизированного исследования, среди пациентов РФ, нуждающихся в приёме НАК, частота носительства полиморфизмов генов повышающих чувствительность к варфарину составила: полиморфизмы VKORC1 ‒ 59%; полиморфизмы СYP2C9 ‒ 34%; сочетание любых полиморфизмов СYP2C9
иVKORC1 ‒ 20%; сочетание наиболее неблагоприятных в отношении риска кровотечения полиморфизмов СYP2C9 иVKORC1 ‒13% .
Еще одной проблемой использования АВК является наличие резистентности у пациентов к этим препаратам. При этом полиморфизм гена VKORC1 является не единственной генетической основой кумаринорезистентности.
Полиморфизм гена АРОЕ также может определять дозу варфарина длядостижениятерапевтическогоуровнягипокоагуляции. АРОЕ ‒ген, кодирующийаполипопротеинЕ(АРО-Е), локализованныйнамембране гепатоцитов и осуществляющий «захват» ими витамина К. Так, Kohnke
исоавт. (2005) показали, чтоуносителейаллеляАРОЕ*Е4 наблюдается болееинтенсивныйзахватгепатоцитамивитаминаК, поэтомунеудивительно, что таким пациентам требовалась большая доза варфарина для достижениятерапевтическогоуровнягипокоагуляции[2].
27
Таким образом, изучение полиморфных маркеров генов, изменения в которых могут приводить к кумаринорезистентности (VKORC1 и АРОЕ), а также генов, изменения в которых обусловливают повышенную чувствительность к непрямым антикоагулянтам (СYР2С9, VKORC1), является перспективным подходом, позволяющим индивидуализировать терапию непрямыми антикоагулянтами. В будущем ожидают появления генетического чипа, с помощью которого можно будетпрогнозироватьчувствительностьпациентовкнепрямымантикоагулянтам, что позволит выбирать оптимальный режим дозирования препаратов. По-видимому, подобный подход будет способствовать повышению эффективности и безопасности фармакотерапии непрямыми антикоагулянтами.
Несколько алгоритмов дозирования для прогнозирования необходимой дозы варфарина, которые включают клинические факторы и демографические переменные, были утверждены в клинической практикевпоследниегоды[6-8]. Недавноинформация, получаемаяиз генетических исследований, была также реализована в этих моделях. Алгоритмы, включающие фармакогенетику для определения дозы варфарина, показывают, что возможно уменьшить риск осложнений, связанных с передозировкой во время индукции варфарина [2].
В 2007 году Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами США (FDA) утвердила дополнение к информации по назначению варфарина, предлагающее назначать варфарин, основываясь на генетическом анализе [4].
Поданнымцентрагемостазаг. Архангельскафармакогенетическое тестированиебылопроведеноу91 пациентанабазеДНК-лаборатории Северного государственного медицинского университета (СГМУ). Стандартная доза варфарина сравнивалась с фармакогенетической, расcчитанной по алгоритму Gage [2].
Кроме того, генетический анализ не является широко доступным. Поэтому другие исследователи предпочитают стандартизированные схемы назначения варфарина без генетического тестирования. В ис- следованииЛазо-Лэнгнераисотрудниковбылопоказано, чтостандартизированное назначение варфарина безопасно, и поддерживающую дозу варфарина можно точно спрогнозировать, учитывая индивидуальную реакцию пациента на введение препарата, т.е. без необходи-
28
мости в дорогом генетическом анализе [10]. Такие клинические исходы, как кровотечения, редки у пациентов антикоагулянтных клиник, есливарфаринотерапияиндивидуализированаитщательноконтролируется. Втакихслучаяхгенетическийанализзначительнонеулучшит безопасность терапии. Поэтому в настоящее время генотипирование не является вариантом скрининга всех пациентов. Тем не менее, нет единого мнения относительно того, каким группам пациентов было бы выгодно проводить подобный скрининг.
Такимобразом, фармакогенетическоетестированиевклинической практике целесообразно проводить:
у пациентов с высоким риском развития НЛР;
перед назначением ЛС с узким терапевтическим диапазоном;
перед назначением ЛС с большим спектром НЛР;
перед назначением ЛС, которое вызывает НЛР;
если планируют длительное применение ЛС.
Методика генотипирования
(цитируется из «Исследование Фармакогенетики Варфарина и Клопидогрела для оптимизации антитромботической терапии» [11])
Специальной подготовки к исследованию не требуется. Источником генетического материала для анализа обычно служит цельная кровь, забор которой происходит в пробирку с консервантом (ЭДТА). После взятия крови пробирку несколько раз переворачивают для предотвращения образования сгустков.
Генотипирование чувствительности к варфарину проводится методом полимеразой цепной реакции (ПЦР) с анализом кривых плавления. Данный метод молекулярной диагностики является наиболее эффективным и широко распространенным в сфере фармакогенетических исследований in vitro. Принципиальным преимуществом его использования является возможность выявления генетически обусловленной чувствительности пациента к лекарственным веществам и определения индивидуальной дозы препарата на начальном этапе лечения.
ПринципметодаПЦРбазируетсянаамплификации(многократном
29
увеличении) определенных фрагментов ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы и праймеров – искусственно синтезированных олигонуклеотидов, которые идентичны искомым участкам ДНК-мишени инеобходимыдляначаласинтезакомплементарнойцепи. Дляидентификации образовавшихся продуктов амплификации (ампликонов) используются зонды – искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера, соединенные с флуоресцентными метками. В результате специфического взаимодействия зондов с ампликонами происходитвысвобождениеметкии, какследствие, наблюдаетсяфлуоресценция.
Наиболее эффективным вариантом метода ПЦР на современном этапе является ПЦР с детекцией результатов в режиме «реального времени» – ПЦР-РВ.
Вэтом случае амплификация фрагментов генов и их идентификация путем измерения флуоресценции проходят одновременно, что существенно сокращает
время проведения анализа от момента взятия материала до выдачи результатов исследования. Для определения генетически обусловленной чувствительности к варфарину использование метода ПЦР-РВ особенно актуально с точки зрения возможности получения данных
офармакогенетических особенностях пациента в ближайшие сутки, так как это позволяет снизить риск развития кровотечения в результате передозировки препарата при подборе индивидуальной дозы у больных.
Воснове генетических особенностей, обусловливающих индивидуальную
чувствительность к варфарину, лежат одиночные нуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphisms – SNPs) – CYP2С9, VKORC1, CYP4F2 (подробно – см. главу IV). Для их выявления методом ПЦР в режиме «реального времени» были использованы комплекты реагентов и детектирующий амплификатор серии ДТ производства компании «ДНК-Технология».
Предлагаемый компанией «ДНК-Технология» подход позволяет минимизировать ошибку интерпретации аллельных вариантов, обеспечивает максимальную стабильность и воспроизводимость результатов.
30