Материал: Методичка Часть 2 леч пед МПФ. Част МБ и ВИР

Б. Бактериологический

Материал: гной из мочеполовых органов, конъюнктивы глаза, синовиальная жидкость, кровь

Специальная среда

Специальная питательная среда

Микроскопия

В. Серологический - РСК

Контрольные вопросы

Каким образом решается вопрос о выборе антибиотиков для лечения заболеваний, вызванных стафилококками?

Как и с какой целью осуществляют фаготипирование стафилококков?

Какова морфология, тинкториальные и культурные свойства гонококков и менингококков? В чем отличие их биохимических свойств?

Какие заболевания вызывает менингококк, какой материал берется при разных формах менингококковых заболеваний и как он исследуется?

Как осуществляют микроскопическую диагностику гонореи? На основании каких признаков делается заключение об обнаружении гонококков в микропрепарате из гнойного отделяемого?

Как осуществляют бактериологическую и серологическую диагностику гонококковых заболеваний?

Каковы морфология, культуральные и биохимические свойства пневмококков? На основании каких свойств можно отличить пневмококки от стрептококков?

Каково антигенное строение пневмококков, как они классифицируются?

23

В. Иммунологический метод диагностики менингококковых заболеваний

Для диагностики менингококковых инфекций помимо классического бактериологического способа используют также различные серологические реакции, позволяющие обнаружить антигены возбудителя в спинномозговой жидкости и в крови. С этой целью применяют реакции коагглютинации, латекс-агглютинации, встречного иммуноэлектрофореза, реакцию пассивной гемагглютинации и эритроиммуноадсорбцию. Последний метод предложен, в частности, для обнаружения полисахаридного антигена серогруппы А (наиболее частого возбудителя менингита). Суть метода заключается в том, что луночки полистиролового планшета сенсибилизируют противоменингококковыми антителами, затем в них добавляют исследуемый материал, содержащий искомый антиген. Смесь инкубируют при 37°C в течение 30-60 мин для связывания антигена антителами. После отмывания в луночки добавляют эритроцитарный диагностикум (эритроциты, несущие антитела к менингококку группы А). В качестве положительного контроля в одну из луночек добавляют полисахарид группы А, отрицательного - эритроциты без антител. Реакцию учитывают через 20 мин седиментации при 22°C визуально и оценивают по 4-х крестной системе. В случае положительной реакции комплекс антитело-антиген взаимодействует с сенсибилизированными эритроцитами, в результате образуется гомогенный слой эритроцитов, фиксированных на стенках луночек. При отрицательной реакции эритроциты скатываются на дно, образуя компактный осадок.

Методы микробиологической диагностики пневмококковой инфекции А. Бактериологический

Материал: мокрота, кровь, гной, экссудат, отделяемое носоглотки, спинномозговая жидкость.

25

Б. Биологический

Материал, сильно загрязненный, вводят внутрибрюшинно белым мышам

Приложение к ЗАНЯТИЮ 4

А. Фаготипирование стафилококков

Фаготипирование стафилококков, как и многих других возбудителей бактериальных инфекций, проводится исключительно для эпидемиологических целей – для более тонкого типирования возбудителя внутри вида, что помогает найти источник инфекции и определить пути еѐ распространения.

Для типирования патогенных плазмокоагулирующих стафилококков используют международный набор из 23 умеренных бактериофагов. Эти фаги разделены на группы:

1 группа - фаги 29, 52, 52А, 79, 80; 2 группа - фаги ЗА, ЗС, 55, 71;

3 группа - фаги 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А, 84, 85; 4 группа - фаги 94 ,95 ,96; и вне групп фаг 81.

Перед работой набор сухих фагов стерильно растворяют в щелочном бульоне (рН- 7,6) с 0,4% глюкозы и 0,02% CaCl2 . В ампулу добавляют I мл бульона и получают разведение фага 10-1. Из этого основного разведения готовят два рабочих разведения, соответствующие тест-разведению (ТР) и 100 ТР. Разведение, соответствующее 1 ТР, указано на этикетке фага.

Степень лизиса культуры разными разведениями фага регистрируется по следующей схеме:

++++ сливной, полный лизис,

+++ полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса), ++ наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 колоний фага (пятен лизиса), + от 20 до 50 колоний фага,

—полное отсутствие лизиса.

Наивысшее разведение, вызвавшее лизис эталонного штамма на +++, называется тест разведением (I TP) фага. Например, если на этикетке указано, что I ТР данной серии фага 10-3, то для получения I TP надо из разведения 10-1 сделать два последовательных десятикратных разведения, и разведение 10-3 будет соответствовать I ТР.

Методика фаготипирования

Суточную агаровую культуру стафилококка засевают в 2,5 мл бульона Хоттингера, Мартена или МПБ (рН 7,2-7,4) и выращивают 3-4 часа при 37°C (до появления заметной мути).

Одновременно готовят чашки с 1,2% агаром, приготовленным на бульоне Хоттингера с добавлением свежей мясной вода (рН 7,6; глюкозы 0,4%). CaCl2 добавляют в расплавленный агар непосредственно перед разливом (0,2 мл стерильного 10%-ного раствора CaCl2 на 100 мл агара). По 25-30 мл расплавленного агара разливают в чашки Петри и после застывания подсушивают чашку 30-40 минут при 37°C. Затем 3-4-часовую испытуемую культуру стафилококка пастеровской пипеткой засевают газоном, избыток культуры удаляют пипеткой, а чашку подсушивают 30-40 минут.

26

Дно засеянной чашки расчерчивают карандашом на 23 квадрата и в каждый квадрат засеянной среды стандартной петлей (диаметр 2 мм) или тонко оттянутой пипеткой наносят каплю соответствующего фага всегда в одном и том же порядке.

После подсыхания фага чашку переворачивают крышкой вниз и инкубируют 18-20 часов при 30°C или 5-6 часов при 37°C и оставляют до следующего утра при комнатной температуре.

Фаготипирование начинают рабочим разведением фагов, соответствующим I ТР. Штаммы, с которыми получен отрицательный результат, на следующий день типируют повторно, используя разведения фагов, соответствующие 100 ТР (разведение 1:10) в нашем опыте.

Учет и регистрация результатов

Штамм считается типируемым, если хотя бы один фаг вызвал сильную реакцию при типировании I ТР или 100 ТР. Стафилококковые штаммы чаще лизируются не одним, а несколькими фагами, что дает для каждого штамма характерную для него фагомозаику. В зависимости от фагов, входящих в эту мозаику, штамм стафилококка относят к тем или иным фагогруппам.

Б. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам

а) Метод дисков. Бумажные диски, пропитанные определенными антибиотиками, помещают на газон исследуемой бактериальной культуры в чашке Петри, Посевы инкубируют в течение 16-24 часов, после чего учитывают результаты опыта по образованию зон задержки роста бактерий.

По диаметру зон задержки роста ориентировочно судят о степени чувствительности бактерий к антибиотикам (рис. 2). Зона задержки роста до 15 мм указывает на слабую, до 25 мм - на среднюю и свыше 25 мм - на высокую чувствительность. Более точные результаты получают при использовании метода серийных разведений.

б) Метод серийных разведений. Этот метод позволяет определить минимальную задерживающую концентрацию антибиотика для данного микроорганизма (МЗК) как на жидких, так и на плотных питательных средах.

МПБ разливают по 2 мл в серию пробирок. Готовят основной раствор антибиотика, для чего берут навеску антибиотика и растворяют в дистиллированной воде из расчета 1 мг антибиотика на мл растворителя.

Левомицетин предварительно растворяют в 96° этиловом спирте из расчета 0,25 мл спирта на 1 мг антибиотика; после полного растворения добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы раствор содержал в 1 мл 1 мг антибиотика.

Тетрациклин и окситетрациклин растворяют в сантинормальном растворе соляной кислоты из расчета 1 мл на 1 мг антибиотика.

Эритромицин сначала растворяют в чистом метиловом спирте из расчета 1 мл на 10 мг эритромицина. После растворения добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы получить раствор, содержащий в 1 мл 1 мг антибиотика.

Исходный раствор антибиотика в количестве 2 мл вносят в первую пробирку с МПБ, перемешивают и получают определенную его концентрацию.

Из первой пробирки 2 мл разведенного антибиотика переносят во вторую пробирку и после перемешивания переносят 2 мл в третью пробирку и т.д. до предпоследней, откуда 2 мл выливают. Последняя пробирка является контролем, в ней нет антибиотика и она свидетельствует о пригодности среды для роста культуры.

После разведения антибиотика во все пробирки вносят по 0,1 мл испытуемой бульонной культуры. Для этого используют 3-4-часовые или 18-часовые культуры, разведенные МПБ в 50 раз.

Пробирки помещают в термостат на 12-18 часов, но предварительные результаты можно учитывать через 6-8 часов.

27