Материал: Методы
Конфигурация cell-attached позволяет двумя путями (в зависимости от задач исследователя) сформировать конфигурацию, называемую whole-cell. В одном случае для ее получения в пипетку необходимо резко и одномоментно подать небольшое отрицательное давление, разрывающее мембрану под пипеткой и образующее путь между внутренней средой клетки и раствором в пипетке. При этом в мембране возникает дырка, величина которой позволяет осуществлять обмен ионов и различных соединений между пипеткой и цитоплазмой (см. рис. 2, г). В другом случае низкоомный путь между внутренней средой клетки и раствором в пипетке формируется благодаря влиянию соединений, находящихся в пипетке и вызывающих образование в мембране пор, проницаемых для ионов, но не для молекул. Это перфоративный (perforated) patch. Эта методика позволяет исследовать ионные токи, протекающие через мембрану, идентифицировать и вычленить их.
Конфигурация whole-cell позволяет сформировать еще один вариант конфигурации – outside-out patch (см. рис. 2, д). Медленное оттягивание пипетки от клетки заставляет мембрану растягиваться до тех пор, пока она не отделится от клетки и не сошьется.
Теперь ее внутренняя часть будет контактировать с раствором в пипетке, а внешняя – с омывающим раствором в перфузионной камере. Данную конфигурацию применяют для изучения вклада соединений внешней среды клетки в активность единичных каналов.
6. Методика регистрации величины потенциала покоя нейрона.
При образовании потенциала покоя внутренняя сторона мембраны заряжена отрицательно, так как ионы калия по градиенту концентрации выходят через каналы утечки, а наружная сторона мембраны – положительно.
Чтобы измерить потенциал покоя и тем более проследить его изменения, вызываемые каким-либо воздействием на клетку, применяют технику внутриклеточных микроэлектродов. Микроэлектрод устанавливают над исследуемым объектом, а затем при помощи микроманипулятора - прибора, снабженного микрометрическими винтами, вводят внутрь клетки. При удачном введении микроэлектрода мембрана плотно охватывает его кончик, и клетка сохраняет способность функционировать в течение нескольких часов, не проявляя признаков повреждения.
Микроэлектрод является активным электродом (референтным). Электрод сравнения (индифферентный) обычных размеров погружают в нормальный солевой раствор, в котором находится исследуемая ткань.
До прокола мембраны микроэлектродом разность потенциалов между активным и индифферентным электродом равна нулю. Kак только микроэлектрод прокалывает поверхностную мембрану клетки, регистрируется разность потенциалов между раствором, омывающим клетку, и содержимым клетки, равная потенциалу покоя клетки. Продвижение микроэлектрода внутри протоплазмы или изменение положения электрода внутри клетки на показаниях вольтметра не сказываются. После прокола микроэлектродом мембраны на противоположной стенке клетки от входа в клетку электрода разность потенциалов вновь не регистрируется. Это свидетельствует о том, что разница потенциал действительно определяется между цитоплазмой и окружающим клетку наружным раствором.
7. Методика Определения групп крови в системе ав0. Правило переливания крови.
Определение группы крови с использованием изогемагглютинирующих (стандартных) сывороток. Группы крови определяют путем постановки реакции агглютинации крови реципиента (человека, которому переливают кровь) со стандартными сыворотками I–IV групп крови, полученных от доноров. Стандартные сыворотки содержат только агглютинины соответствующих групп. Сыворотки отличаются друг от друга по цветам.
На пластинку наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартных сывороток соответствующих групп. Рядом с каждой каплей сыворотки наносят маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови, соблюдая соотношение 10:1. Капля вносимой в сыворотку крови должна быть меньше объема капли сыворотки, чтобы не снизить титра содержащихся в них агглютининов. Смешивают каплю сыворотки с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой, затем, периодически покачивая пластинку, наблюдают за ходом реакции в течение 5 мин.
Агглютинация начинается в течение первых 10–30 с, однако наблюдение следует вести до 5. Через 3 мин в капли смеси сыворотки с эритроцитами, в которых наступила агглютинация, добавляют по одной капле (0,05 мл) изотонического раствора хлорида натрия и продолжают наблюдение при периодическом покачивании пластинки до истечения 5 мин.
Определение группы крови перекрестным способом проводится одновременно при помощи изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов. При этом способе определяют наличие или отсутствие агглютиногенов и, кроме того, при помощи стандартных эритроцитов устанавливают наличие или отсутствие групповых агглютининов.
Для определения групповой принадлежности крови применяют также стандартные реагенты — моноклональные антитела (цоликлоны) (анти-А и анти-В), реагент содержит краситель (розовый— для антител анти-А, синий— для антител анти-В). Моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса М.
Определение групп крови антителами анти-А и анти-В имеет ряд преимуществ по сравнению с определением изогемагглютинирующими сыворотками: обеспечиваются более высокие качество агглютинации, достоверность и надежность результатов, заметно упрощается процедура определения и сокращаются сроки реакции (наступает уже в первые 1–2 с).
Компоненты крови должны переливаться только той группы системы АВ0 и той резус-принадлежности, которая имеется у реципиента.
По жизненным показаниям:
При отсутствии одногруппных по системе АВ0 компонентов крови (за исключением детей) допускается переливание резус-отрицательной крови I группы(отмытой) рецепиенту с любой другой группой крови в количестве до 500 мл.
Резус-отрицательная отмытая эритроцитарная масса от доноров II и III групп могут быть перелиты рецепинту с IV группой, независимо от его резус-принадлежности.
При отсутствии одногруппной плазмы рецепиенту может быть перелита плазма IV группы.
8. Лейкоциты, количественная характеристика. Лейкоцитарная формула крови.
Лейкоциты: норма - 4*109-10*109 в литре.
Лейкоцитарная формула:
9. Количественные показатели в анализах крови и мочи, отражающие функцию почек.
Для диагностики нарушения работы почек существуют специальные лабораторные тесты:
1. Биохимическое исследование крови на определенные показатели, которые отражают функциональное состояние почек;
2. Определение скорости клубочковой фильтрации (СКФ);
3. Анализы мочи.
Креатинин относится к беспороговым веществам, которые не подвергаются процессу реабсорбции в почечных канальцах и полностью выводятся мочевыделительной системой при любой их концентрации в крови. При стабильной мышечной нагрузке и хорошей работе почек концентрация его в крови у человека достаточно постоянна. Поэтому уровень креатинина в крови напрямую отражает функциональное состояние почек (у мужчин норма 80-115 мкмоль/л, у женщин – 53, 97 мкмоль/л).
Мочевина. Образование мочевины проходит в несколько этапов: при распаде белков образуется аммиак — токсичное для организма вещество; аммиак нейтрализуется клетками печени, превращаясь в мочевину, которая выводится из организма почками. Данное химическое соединение организм никак не использует, а только избавляется от него. Так как процесс образования мочевины непрерывный, небольшое количество вещества постоянно находится в крови (норма 2.5-8.3 ммоль/л).
Мочевая кислота. Образуется в результате обмена пуринов — азотсодержащих веществ, входящих в состав нуклеиновых кислот. Кроме этого, мочевая кислота является результатом переваривания продуктов с высоким содержание пуринов. Большая часть вещества выводится из организма почками, меньшая — желудочно-кишечным трактом (норма у мужчин 220-420 мкмоль/л, у женщин – 40-340 мкмоль/л).
Общий белок. Показатель отражает концентрацию всех белков в крови и служит маркером не только почечных патологий, но также заболеваний печени, щитовидной железы и других органов (норма 65-85 г/л).
Определение СКФ по клиренсу эндогенного креатинина (проба Реберга). Креатинин - конечный продукт креатин-фосфатной реакции. Креатинин образуется в мышцах и затем выделяется в кровь. Концентрация эндогенного креатинина в крови практически постоянна (в условиях покоя). Креатинин фильтруется, не реабсорбируется и обычно не секретируется. Всё количество креатинина, которое профильтровалось выделяется из организма со вторичной мочой. Значит, количество креатинина в первичной моче равно количеству креатинина во вторичной моче. В ряде случаев креатинин секретируется, поэтому результат бывает неточным (норма 90-140 мл/мин).
Микроальбумин в моче — это важный показатель нарушения функции почек. Микроальбуминурия — это патология, при которой почки выделяют белок альбумин в количествах, превышающих норму, но не достигших степени протеинурии. Главная причина появления микроальбумина в моче — повышение проницаемости почечного фильтра. Это состояние возникает как осложнение при сахарном диабете, артериальной гипертензии, хронической сердечной недостаточности, воспалительных заболеваниях почек. В норме в моче присутствует небольшое количество альбумина, но при повреждении почечных клубочков (даже незначительном) содержание в моче альбумина стремительно увеличивается. Как правило, сначала выводятся альбумины небольшого размера (микроальбумины). Но по мере прогрессирования заболевания в моче обнаруживаются и более крупные фракции альбумина. В этом случае анализ показывает присутствие в моче белка. Дальнейшее развитие заболевания грозит нарушением общего кровообращения в почках, снижением их функции и развитием хронической почечной недостаточности (норма – менее 30 мг/cут, микроальбуминурия – 30-300 мг/cут, протеинурия – более 300 мг/сут).
Общий анализ мочи (основные показатели):
1. Количество. Суточный диурез колеблется в пределах 70—80 % всей употребленной воды, что соответствует 1,5—2 литрам при обычном питании.
2. Цвет. Цвет мочи в норме колеблется от соломенного до насыщенного жёлтого, он определяется присутствием в ней красящих веществ — урохромов, концентрация которых в основном и определяет интенсивность окраски. Насыщенный жёлтый цвет обычно указывает на относительную высокую плотность и концентрированность мочи. Бесцветная или бледная моча имеет низкую плотность и выделяется в большом количестве.
3. Запах (например, при запахе кетона – кетонурия).
4. Пенистость. При взбалтывании мочи на её поверхности образуется пена. У нормальной мочи она необильная, прозрачная и нестойкая.
5. Прозрачность. Моча в норме прозрачна. Помутнение может вызываться бактериями, клеточными элементами, солями, жиром, слизью.
6. Плотность. В норме плотность мочи 1010—1024 г/л. Плотность может быть повышена при обезвоживании. Сниженная плотность может свидетельствовать о почечной недостаточности.
7. Кислотность. Обычно показатель pH мочи колеблется от 5,0 до 7,0. Кислотность мочи сильно изменяется в зависимости от принимаемой пищи и физической нагрузки.
Также для определения скорости клубочковой фильтрации используется определение клиренса инулина. Клиренс – коэффициент очищения плазмы крови от инулина (мл/мин). Инулин (полимер фруктозы) вводится внутривенно. Инулин фильтруется в почечных клубочках, не реабсорбируется и не секретируется в канальцах. Все количество инулина, которое профильтровалось, выводится с конечной мочой. Зная концентрацию инулина в плазме крови, количество конечной мочи и концентрацию инулина в конечной моче, можно рассчитать объем плазмы, который профильтровался в клубочках (т.е.объем первичной мочи). Это и есть показатель скорости клубочковой фильтрации.
Объем почечного кровотока можно определить по клиренсу парааминогиппуровой кислоты. ПАГ вводится внутривенно. ПАГ фильтруется в почечных клубочках, не реабсорбируется и дополнительно секретируется в канальцы. Таким образом, весь объем протекающей плазмы очищается от ПАГ за время однократной циркуляции крови через почки. Зная концентрацию ПАГ в плазме крови, количество конечной мочи и концентрацию ПАГ в конечной моче, можно рассчитать объем плазмы, который протекал через почки. Клиренс ПАГ равен плазмотоку через почки (в норме 600 мл/мин). Зная показатель гематокрита, можно рассчитать объем почечного кровотока за минуту.
Пороговые вещества – обычно полностью реабсорбируются (глюкоза, аминокислоты, фосфат, бикарбонат) и выделяются с мочой только если их концентрация в плазме крови превышает пороговую величину (так называемый «порог выведения»). Для глюкозы порог выведения 10 ммоль/л (при нормальной концентрации глюкозы в крови 4.4-6.6 ммоль/л).