Материал: Методы

10. Методика количественного подсчета эритроцитов и лейкоцитов в крови взрослого человека.

Для подсчета количества указанных клеток крови чаще используют счетные камеры и электронно-счетные приборы. При подсчете числа клеток крови применяют различные счетные. Наибольшее распространение получила счетная камера Горяева. Счётная камера представляет собой толстое предметное стекло, в средней части которого имеются четыре желобка. Между ними образуются три узкие пластинки. Средняя пластинка ниже боковым на 0.1 мм и разделена пополам поперечным желобком. По обе стороны от желобка расположены сетки. Так как высота боковых пластинок на 0.1 мм больше средней, то при наложении на них покровного стекла над сеткой образуется камера глубиной в 0.1 мм. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов (15 x 15). Каждый третий квадрат разделён дополнительно поперечными и продольными линиями на 16 маленьких квадратиков. Таких больших квадратов, разделённых на маленькие, в сетке 25.

С торона маленького квадратика равняется 1/20 мм, площадь 1/20 * 1/20 – 1/400 мм²; так называемый «объём малого квадратика» равен 1/400 * 1/10 = 1/4000 мм³.

Для разбавления крови пользуются смесителями. Смеситель представляет собой пипетку с ампулообразным расширением. В ампуле находится стеклянная бусинка для наилучшего размешивания крови. На капилляре нанесены две метки: 0,5 и 1; третья метка стоит за ампулообразным расширение: на смесителе для эритроцитов – 101, на смесители для лейкоцитов – 11. Для разбавления крови при подсчёте эритроцитов используют 3% раствор хлорида натрия, в котором эритроциты сморщиваются; для подсчёта лейкоцитов применяют 5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовой синью. Кислота разрушает оболочки форменных элементов, а краска окрашивает ядра. При этом эритроциты становятся невидимыми и не мешают подсчёту лейкоцитов. В смеситель для эритроцитов насасывают кровь до отметки 0,5, а затем переносят в раствор хлорида натрия и насасывают его до метки 101 (т.е. разводят в 200 раз). Кровь в смеситель для лейкоцитов также набирают до отметки 0,5, а затем уксусную кислоту до отметки 11 (т.е. разводят кровь в 20 раз).

Далее берут заполненный смеситель для эритроцитов и встряхивают его. Затем наносят небольшую капельку на сетку камеры и плотно закрывают её покровным стеклом. Излишек раствора при этом стекает в желобки. Заполнив камеру, ставят её под микроскоп, и, если форменные элементы расположены равномерно (что является показателем хорошего перемешивания крови), приступают к подсчёту. Подсчиты­вают эритроциты в левом верхнем большом квадрате (раз­деленном на 16 маленьких квадратиков), а затем еще в 4 больших квадратах по диагонали сетки (всего в 5 больших квадратах). Подсчет клеток в боль­шом квадрате начинают с левого верхнего маленького квадратика, а далее перехо­дят во 2, 3 и 4-й квадратики. После верхнего ряда считают эритроциты в ниже­расположенном ряду, на­чиная с 1-го правого квадра­тика и т. д. Эритроциты внутри маленьких квадрати­ков, а также на верхней и левой сторонах большого квадрата сосчитывают, а эритроциты на нижней и пра­вой сторонах не учитывают (правило Егорова). Подсчитав таким образом число эритроцитов (А) в 5 больших квадратах (что составляет 80 маленьких), находят среднее арифметическое число эритроцитов в одном маленьком квадратике (А/80). Зная, что объём части камеры над одним маленьким квадратиком 1/4000 мм³, умножают найденное число на 4000. Получается число эритроцитов в 1 мм³ разведённой крови. Умножив на разведение – 200, получают количество эритроцитов в 1 мм³ цельной крови. Таким образом, формула для вычисления количества эритроцитов следующая:

Для получения точных результатов при подсчёте лейкоцитов подсчёт производят в 25 больших квадратах, что составляет 400 маленьких квадратиков. Формула для вычисления количества лейкоцитов в 1 мм³ цельной крови:

11. Количественная оценка сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.

Показатели сосудисто-тромбоцитарного гемостаза

1. Время кровотечения – время, в течение которого идёт кровь при проколе мягких тканей иглой или их небольшом разрезе. Поскольку кровотечение из мелких сосудов останавливается сосудисто-тромбоцитарным гемостазом, то этот тест на него. Нормальное значение 4 минуты.

2. Подсчёт количества тромбоцитов. Нормальное значение 180000-320000 в мкл (180-320 *10⁹ в литре).

3. Из методов оценки ломкости капилляров чаще всего используется манжеточная проба Румпеля-Лееде-Кончаловского. Манжету для измерения АД накладывают на плечо, создавая в ней постоянное давление, равное 100 мм рт. ст. Через 5 минут оценивают результаты пробы. При отсутствии нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза ниже манжеты появляется лишь небольшое количество петехиальных (мелкоточечных) кровоизлияний (менее 10 петехий в зоне, ограниченной окружностью диаметром 5 см). При повышении проницаемости сосудов или тромбоцитопении число петехий в этой зоне превышает 10 (положительная проба).

4. Исследование агрегации тромбоцитов. Наиболее полная оценка агрегационной способности тромбоцитов осуществляется при количественной фотометрической или спектрофотометрической регистрации процесса агрегации с помощью агреографов различной конструкции. Методы заключаются в регистрации изменения оптической плотности тромбоцитарной плазмы при перемешивании её со стимулятором агрегации (например, с АДФ). Образование тромбоцитарных агрегатов ведёт к увеличению светопропускающей способности тромбоцитарной плазмы.

Показатели коагуляционного гемостаза

1. Время свёртывания – время, в течение которого свежевыпущенная кровь сворачивается в пробирке. Очевидно, что этот тест на коагуляционный гемостаз. Нормальное значение 4-8 минут.

2. Протромбиновое время – время, в течение которого сворачивается цитратная кровь (т.е. кровь, в которой связали все ионы кальция добавлением цитрата) после добавления кальция и тканевого фактора. Это тест на внешний (и общий) путь коагуляионного гемостаза, т.к. именно внешний путь запускается тканевым фактором. Нормальное значение 12-14 секунд.

а) Протромбиновый индекс – отношение стандартного протромбинового времени к протромбиновому времени у обследуемого.

б) Международное нормализованное отношение. Этот показатель представляет собой отношение протромбинового времени у обследуемого к стандартному протромбиновому времени, скорректированное с учётом особенностей применяемых в данной лаборатории реагентов.

3. Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) – время, в течение которого сворачивается цитратная кровь после добавления кальция, фосфолипидов и взвеси мелких частиц (последние необходимы для контактной активации двенадцатого фактора). Этот тест на внутренний (и общий) путь коагуляционного гемостаза.

12. Нарисовать кривую диссоциации оксигемоглобина, объяснить и перечислить факторы, на нее влияющие.

Вместо сатурационной кривой для кислорода часто приводят очень похожую на нее кривую диссоциации оксигемоглобина. Она отличается тем, что по вертикальной оси отложена не объемная концентрация кислорода, а степень насыщения гемоглобина кислородом. Горизонтальному участку при этом соответствует насыщение, равное 100%.

Из сопоставления сатурационной кривой для кислорода и кривой диссоциации оксигемоглобина видно, что при 100% насыщении гемоглобина кислородом объемная концентрация кислорода в крови составляет (в норме!) около 20 об%. Рассмотрим, каким образом получается такое значение.

Поскольку подавляющая часть кислорода в крови приходится на химически связанный с гемоглобином кислород, объемная концентрация кислорода в крови зависит от:

1. а) концентрации гемоглобина;

2. б) кислородной емкости гемоглобина, то есть максимального количества кислорода, которое может связать 1 грамм гемоглобина при полном насыщении;

3. в) степени насыщения гемоглобина кислородом:

сО2 = Нb% х КЕ_Нb х sО2

где сО2 — объемная концентрация кислорода; Нb% — концентрация гемоглобина в крови; КЕ_НЬ — кислородная емкость гемоглобина; sО2 — насыщение гемоглобина кислородом.

В идеальном случае для артериальной крови:

1. НЬ% равна 15 г/100 мл;

2. КЕ_Нb равна 1,34 — один грамм гемоглобина при полном насыщении способен связать до 1,34 мл кислорода;

3. sО2 составляет около 100%.

сО2 = 15 (г Нb/100 мл крови) х 1,34 (мл О2/г НЬ) х 100% = 20 (мл О2/100 мл крови)

При снижении рН (увеличении парциального давления углекислого газа) кривая смещается вправо, что свидетельствует о снижении сродства гемоглобина к кислороду. Это имеет значение для активно работающих тканей. Следовательно, омывая активно работающие ткани, кровь отдает им еще больше кислорода.

13. Что такое дыхательные объёмы и дыхательные емкости.

Дыхательный объем (ДО) - объем воздуха, который вдыхается и выдыхается за каждый дыхательный акт.

Частота дыхания (ЧД) - число дыхательных движений в 1 мин.

Минутный объем дыхания (МОД) – объем, который вентилируется через легкие за 1 мин МОД = ДО × ЧД.

У взрослого человека ДО составляет около 500 мл, а МОД 6-8 л/мин. Необходимо отметить, что величины ЧД и ДО очень индивидуальны.

Резервный объем вдоха - максимально возможный объем, который можно дополнительно довдохнуть после

спокойного вдоха. У взрослого человека он составляет около 2 л.

Резервный объем выдоха - максимального возможный объем, который можно дополнительно выдохнуть после спокойного выдоха. Он составляет около 1,5 л.

Жизненная емкость легких (ЖЕЛ) – максимально возможный объем, который можно выдохнуть после максимально глубокого вдоха, или максимальный объем, который можно вдохнуть после максимально глубокого выдоха. ЖЕЛ = РОвд + ДО + РОвыд

Остаточный объем легких (ООЛ) - объем воздуха, остающийся в легких после максимально глубокого выдоха. Этот объем не может быть определен при спирометрии (100-1500 мл).

Функциональная остаточная емкость легких (ФОЕ) - объем воздуха в легких на глубине спокойного выдоха. ФОЕ = РОвыд + ООЛ

Емкость вдоха – максимальный объем, который можно вдохнуть после спокойного выдоха. Евд = ДО+РОвд

Общая емкость легких (ОЕЛ) - объем воздуха в легких на глубине максимально глубокого вдоха. Уменьшение ОЕЛ это основной признак рестриктивного синдрома. ОЕЛ =ЖЕЛ +ООЛ = ФОЕ +Евд.

Таким образом, выделяют 4 объема (ДО, РOвд, РОвыд, ООЛ) и 4 емкости (ЖЕЛ, ОЕЛ, Евд, ФОЕ).

14. Показатели вентиляции легких: минутный объем дыхания, альвеолярная вентиляция, максимальная вентиляция легких. В чем различие между понятиями легочной и альвеолярной вентиляцией.

Показатели вентиляции:

1. Минутный объём дыхания (МОД) – объём воздуха, проходящий через лёгкие за минуту (в покое 6-8 литров).

2. Максимальная вентиляция лёгких – тот объём воздуха, который мог бы пройти через лёгкие за минуту при максимально интенсивном (частом и глубоком) дыхании.

3. Альвеолярная вентиляция – часть минутного объёма дыхания, достигающая альвеол.

МВЛ отражает максимальные резервы дыхательной системы, которые никогда не используются: МВЛ может достигать 180 л/мин, а МОД даже при самой интенсивной нагрузке не превышает 100 л/мин. Чтобы рассчитать МВЛ, человека просят дышать максимально интенсивно в течение 10 с и полученный объем воздуха перерассчитывают на 1 мин.

МОД всегда больше АВ, так как часть МОД идет на вентиляцию мертвого пространства.

Динамические показатели связаны со статическими, а именно с дыхательным объемом и объемом мертвого пространства, через частоту дыханий:

МОД = ДО * ЧД

АВ = (ДО - ОМП) * ЧД

15. Формы переноса кислорода в крови. Содержание о2 крови, его транспорт. Кислородная емкость крови, коэффициент утилизации.

Кислород транспортируется в двух видах: в виде оксигемоглобина (19-20 мл на 100 мл крови), в растворённом виде в плазме (0,3 мл на 100 мл крови).

Гемоглобин – хромопептид, состоящий из белка глобина и четырёх молекул гема. Белок глобин представлен двумя бета-полипептидными цепями и двумя альфа-полипептидными цепями. Основная масса О2 переносится благодаря химическому соединению с гемоглобином. Гемоглобин способен свободно и обратимо связывать молекулу О2 при помощи координационных связей. При этом кислород не переходит в ионную форму, а переносится в виде молекулы. Каждый атом железа может связывать одну молекулу кислорода, в гемоглобине четыре атома железа  одна молекула гемоглобина переносит четыре молекулы кислорода. Образовавшееся соединение носит название оксигемоглобин. Оксисгемоглобин транспортируется кровью к тканям, где происходит его расщепление и отдача О2 тканям.

Кислородной ёмкостью крови называют максимальное количество кислорода, которое может связать кровь при полном насыщении гемоглобина кислородом. Одна молекула гемоглобина может присоединять четыре молекулы О2. Следовательно, 1 г гемоглобина может присоединять 1,39 мл О2. Обычно это значение принимают равным 1,34, а число 1,39 отражает ситуацию с химически чистым гемоглобином. Так как в крови содержится 150 г гемоглобина в одном литре, а один грамм гемоглобина переносит 1,34 мл кислорода, то кислородная ёмкость крови 150 * 1,34 = 208 мл/л (20 об%). В венозной крови в 100 мл крови содержится 12 мл кислорода, а в артериальной в 100 мл крови – 20 мл кислорода.