Дифференциал-диагностич среды — это спец смеси питат в-в, примен для опред вид принадлежности микробов и изучения их св-в. При росте бак на дифф-диаг средах протекают хим процессы, обусловленные наличием у микробной кл различных ферментов. 1 из них способны расщеплять белки, др — углеводы, 3и — вызывать р-ции окисл и восстановл. Благодаря д-вию ферментов в дифференц-диагностич среде происходят соответств изменения. Дифференц-диагностич среды можно разделить на 4 основ гр. 1. Среды, содержащие белок и выявл способность микробов расщеплять белки (протеолитич Св-ва): мясо-пептонная желатина «столбиком», свернутая лошад\бычья сыворотка, молоко, кров агар. При посеве бак проколом в мясо-пептонную желатину, «столбиком» в случае расщепления белка наблюдают разжижение среды. При посеве на среду со свернутой сывороткой расщепление белка опред по разжижению среды и образованию углублений на ее поверхн. Расщепление микробом молока выявл просветлением или растворением первоначально свернувш молока. Наличие гемолитич активности исслед культуры проверяют посевом ее в чашку Петри на специал кровяной агар. В результате разруш эритроцитов вокруг колоний (н, гемолитич стрепток или стафилоко) образуются зоны просветления. 2. Среды для выявл способн микробов расщеплять углеводы и высокоатомные спирты (Эндо с, Левина с, Расселла с, Дригальского — Конради с, Рапопорт — Вайнтрауба с, Шустовой с). Для выявл этих св-в микроорг примен также «пестрый» ряд, т. е. серию пробирок, содерж пит среды, вкл различные углеводы, многоатомные спирты и индикатор. В кач-ве индикаторов пользуются лакмусовой настойкой или бромтимоловым синим. Разложение какого-либо из углеводов с образованием к-ты выявляют по изменению цвета индикатора, образование газа— по заполнению газом и всплыванию спец стеклянного поплавка в жид среде. Или примен полужид Гисса среды с 0,5% агара с соответ сахарами и индикатором Андраде. После посева микроба на эти среды образование к-ты выявл покраснением среды, а образование газа — по появл его пузырьков в агаре или по разрыву и сдвигу вверх агарового столбика. К дифференц-диагностич средам 2ой гр относят также крахмал агар, служащий для опред способности микробов расщеплять крахмал, среду Кларка. 3. Среды, на кот выявл способность микробов обесцвечивать красители, добавл к бульону: метилен синий, тионин, лакмус, индигокармин, нейтрал красный (с Ротбергера, с Омелянского). К 3ей гр относят также среды с нитратами, служащие для опред способности микробов восст соли азотной к-ты (нитраты) в соли азотистой к-ты (нитриты) и далее в аммиак или свободный азот. 4. Среды, выявл способность микробов усваивать в-ва, кот не усваиваются др микробами, н среда с лимоннокислым натрием (цитратный агар Симонса) для отличия киш палочки, кот лишена способности ассимилировать эту среду, от др бак киш гр или среда с олеиновокислым натрием для дифференциации дифтерийной палочки от ложнодифтерийной и дифтероидов (агар Энжеринга). К дифференциально-диагностич средам относят также среды для дифференциации анаэробов, теллуритовые среды для дифференциации дифтерийных бак, среды с мочевиной, щелочные среды (Дьедонне агар) для культивирования холерного вибриона и др. Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, кот его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет. Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолет цвет. Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрал красного, солей желчных к-т, минерал солей. Эта среда также явл элективной, т к подавляет рост многих микробов (киш палочки) и способствует лучшему росту некот болезнетворных бак (возбуд брюш тифа, паратифов).Среды Гисса служат для изучения сахаролитич св-ва микробов. содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бак расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до к-ты и газа – наблюдают появл газообразных продуктов. Жид среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвечен щелочью). В среду опускается поплавок, кот при стерилизации заполн средой. Исход цвет среды – соломенножелтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется. Полужид среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая к-та). Исход цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде. Опред вид бак ферментирует не все, а только некот углеводы в 1их пробирках цвет изменяется, а в др – нет получается "пестрый ряд". Каждый вид бак характеризуется своим "пестрым рядом".
Процесс биологич окисления дает энергию, необход для жизни кл. Сущность процесса заключается в последоват окислении субстратов с постепенным освобождением энергии. Энергия запасается в молекулах АТФ. Окислению подвергаются углеводы, спирты, органич к-ты, жиры и др в-ва. Но для бол-ва микроорг ист энергии служат гексозы, (глюкоза) У микроорг сущ 2 типа биологич окисления: аэробный и анаэробный. При аэробном типе участвует кислород, и этот процесс называется дыханием. При анаэробном типе биологич окисления освобождение энергии из органич молекул происходит без участия кислорода и называется брожением. При аэробном типе дыхания пировиноград к-та вступает в цикл трикарбоновых к-т. Водород ПВК поступает в дыхат цепь. Это цепь окислит ферментов (цитохромы и цитохромоксидаза). По цепи цитохромов передается водород и присоед к активирован под д-вием цитохромоксидазы кислороду с образованием воды. Конечные продукты аэробного окисления глюкозы - диоксид углерода (углек-та) и вода. В процессе дыхания на 1 молекулу глюкозы образуется 38 молекул АТФ. Дыхание (биологич окисление) – окислит-восстановит р-ции, идущие с выделением энергии и образованием АТФ. Субстраты дыхания: глюкоза, аминок-ты, спирты. Аэробное дыхание – участвует кислород. Окислит фосфорилирование (дыхание) – это процесс образования АТФ при переносе электронов от донора к акцептору через дых цепь. Донором электронов могут служить органич (углеводы, жирн к-ты, аминок-ты) и неорганич в-ва: H2S, Fe3+ («сероводородное дых», «железное дых»). Акцептором электронов – только неорганич в-ва, кот восст. При аэробном дых конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород, кот преобразуется в высокотоксич для кл соед: перекись водорода и супероксидный радикал. Аэробные и аэротолерантные (устойчивые к кислороду) прокариоты обладают спец ферментами, супероксид-дисмутазой и каталазой, катализирующ превращение токсич форм кислорода в воду.
Генрих отто виланд. Анаэробное дыхание – без участия кислорода. При аэробном расщеплении выделяется значительно больше энергии, т.е. оно энергетически более выгодно, чем анаэробное расщепление.В кл облигатных анаэробов эти ферменты отсут, поэтому кислород губительно д-вует на данные бак. При анаэробном дых конечным акцептором электронов служат неорганич в-ва, содержащие «связанный кислород» (нитраты, нитриты, сульфаты, карбонаты): нитраты восст до молекулярного азота или аммиака («нитратное дых»), а сульфаты восст до сероводорода («сульфатное дых»). Процесс переноса электронов от донора к акцептору при дыхании вкл след этапы: 1. Окисление субстрата с переносом электронов на внутр акцептор кл (НАД, ФАД, НАДФ) через ЦТК (в результате 1го оборота цикла происходит 2 декарбоксилирования, 4 дегидрирования и 1 субстратное фосфорилирование); 2. Перенос электронов по дыхат цепи с образованием АТФ; 3. Перенос электронов на внеш акцептор и возвращение дыхат цепи в исходное состояние. Начал этап анаэробного расщепления глюкозы с образованием пировиноград к-ты (ПВК) происходит одинаково с аэробным. Эта к-та явл тем центр пунктом, от кот расходятся пути дыхания и многих видов брожений. При анаэробном типе биологич окисления энергия образуется в результате брожений. При спиртовом брожении ПВК превращается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Конечным продуктом молочнокисл брожения явл молоч к-та, маслянокисл брожения - масл к-та. При процессах брожения на 1 молекулу глюкозы образуется только 2 молекулы АТФ.
Брожение – метаболич процесс, присущий бак, характ энергетич сторону способа существования нескольких гр прокариот, при кот они осущ в анаэробных условиях окислит-восстановит превращения органич соед, сопровожд выходом энергии, кот эти орг испол. Спиртовое б углеводов вызывают дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), некот виды бак (Sarcina ventriculi) и отдельные предст мукоровых грибов рода Mucor. При спиртовом б молекула гексозы распадается на этанол и углекисл газ. много промежуточных продуктов — гексозомонофосфат, фруктозодифосфат, фосфотриозы, фосфоглицериновая к-та, фосфопировиноград к-та, пировиноград к-та, уксусн альдегид и этил спирт. При содерж в сбраживаемом р-ре более чем 30% сахара часть его остается неиспол, т к при этих условиях образуется до 15% спирта, а при такой концентрации спирт подавляет жизнедеят дрожжей. Уксуснокисл б — биологич окислит процесс, при кот с помощью уксуснокислых бак спирт окисляется в уксусную к-ту. Уксуснокислые бак объединены в род Acetobacter, содерж ряд видов и подвидов. Этиловый спирт под влиянием уксуснокислых бак подвергается окислению, в результате кот вначале образуется уксусн альдегид, а затем — уксусн к-та. При испол спец рас уксуснокислых бак максимал выход уксуса достигает 14,5%. Уксуснокислые бак превращают ряд многоатомных спиртов в сахар. Молочнокисл б — широко распростр биохимич явление, Под влиянием молочнокисл бак (сем Lactobacillaceae) лактоза расщепляется на составляющие ее гексозы — глюкозу и галактозу, кот затем специфич ферментами превращаются в молочн к-ту. молочн к-та отщепляет кальций от казеина, белок превращается в параказеин и выпадает в осадок. представлено большим кол-вом видов палочковид и кокковид бак, различающихся не только по морфологии, но и физиологич св-вам (по испол различных ист углерода и азота). Маслянокислое б. Возбуд маслянокислого б был открыт Л. Пастером. На примере Л. Пастер разработал учение об анаэробах. Типичный предст бак маслянокисл бр - азотфиксирующий Clostridium pasteurianum. Маслянокислое б — сложный биохимич процесс расщепления углеводов, в ряде случаев жиров и белков, на масляную к-ту, углек-ту и воду, много побоч продуктов — уксусн, молочн, пропион и др к-ты. Разложение целлюлозы, Субстратное фосфорилирование (брожение) – это способ получения энергии, при кот происходит сопряженное окисление-востановление субстрата без участия кислорода (в строго анаэробных условиях). Это наиб примитивный способ получения энергии, т.к. из субстрата извлекается лишь незначительная часть содержащейся в нем энергии. биологич сущность доказана в работах Л. Пастера, кот уст, что изменения в органич субстрате – результат жизнедеят микроорг. Процесс брожения протекает в 2 фазы: Начальная (окисление) – расщепление углеводов до пировиноградн к-ты (пирувата) 3мя путями: гликолитич– 2 АТФ и 2 НАДН2; пентозофосфатный (фосфоглюконатный путь) – 2 АТФ, 2 НАДФН, пентозофосфат и СО2; 2-кето-3дезокси-6-фосфоглюконатный (глюкоза без фосфорилирования окисляется в глюконовую к-ту, последняя превращается в 2-кетоЗ-фосфоглюконовую к-ту, кот расщепляется на 2 C3-фрагмента: ПВК и глицериновый альдегид) – наблюдается только у бак рода Pseudomonas, Alcaligenes, у высших орг отсут – 1 АТФ, 1 НАДФ и 1 НАДН2; Конечная (восстановление) – происходит присоед атомов водорода для восст пировиноград к-ты, при этом образуются разные продукты, в зависимости от кот выделяют разные типы брожения. Брожение – неполное окисление в анаэробных условиях.
Облигатные (строгие) аэробы способны получать энергию только путем дыхания и поэтому обязательно нуждаются в молекулярн кислороде. Энергию получают окислит метаболизмом, испол кислород как терминальный акцептор электронов в р-ции, катализируемой цитохромоксидазой. Пример: предст родов Pseudomonas и Bacillus. 2. Облигатные (строгие) анаэробы не способны расти и размножаться в присутст кислорода, поскольку у них отсутст ферменты, расщепляющие токсич соед кислорода. Для них как тип окислит-восстановит процессов характерна ферментация, при кот происходит перенос электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору. Тип метаболизма у них — бродильный. Пример: микроорг родов Clostridium и Bacteroides. 3. Факультативные анаэробы способны расти и размножаться как в присутствии кислорода, так и в его отсутст. Они обладают смешанным типом метаболизма и могут испол в кач-ве терминальных акцепторов электронов как молекулярн кислород, так и органич соед. Процесс получения энергии у них может происходить кислородным дых в присутс кислорода, а в его отсут переключаться на брожение. Пример: Escherichia coli и Saccharomyces. 4. Микроаэрофилы нуждаются в низком содержании свободного кислорода 2-10%. Естест средой обитания микроаэрофилов явл мукозный слой, покрывающий эпителий желудка, где концентрация кислорода невелика. У них имеются ферменты, кот инактивируются при контакте с сильными окислителями и активны только при низких значениях парциального давления кислорода, н фермент гидрогеназа. Многие бак растут быстрее в избыточном кол-ве углекислого газа (до 20%), поэтому их называют капнофилами. Пример: Helicobacter pylori, Campylobacter. 5. Аэротолерантные микроорг способны расти в присутствии атмосферного кислорода, но не испол его в кач-ве ист энергии. Они осущ анаэробн метаболизм (брожение), но устойчивы к д-вию кислорода при его обычных концентрациях. Пример: Streptococcus pyogenes, Lactobacillus.
Окислит-восстановит потенциал (Eh), также редокс-потенциал, характ степень активности электронов в окислит-восстановит р-циях, т.е. р-циях, связанных с присоед или передачей электронов. Обычно в средах за увеличение Eh ответственен кислород; при высоких положит значениях Eh, обусловленных присутствием растворенного кислорода, подавляется рост всех анаэробных бак. В то же вр положит значения Eh, обусловленные присутствием в среде др в-в, могут не препятствовать росту даже строгих анаэробов. Устойчивость к Eh разных анаэробных бак различна. Для выращивания строгих анаэробов важно создание более восстановлен условий, чем те, кот обеспечиваются простым удалением кислорода из культуральной среды. Для 1х микроорг нужен высокий потенциал, для др - низкий. Анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы - при RH2 не ниже 10. По отношению к окислит-восстановит условиям среды микроорг разделяют на 4 основ гр: облигатные аэробы, облигатные и факультативные - анаэробы и микроаэрофилы. Облигатные анаэробы развиваются при низком значении Еh (0-14), факульт анаэробы при Еh (0-30), аэробные микроорг Еh (11-35), микроаэрофилы- Еh (10-20). Аэрация — искусст обогащение пит среды стерильным воздухом или кислородом с целью увеличения выхода биомассы при культивировании (прежде глубинном) аэробных микроорг в жидкой пит среде. Окислит-восстановит условия среды Степень аэробности среды (насыщения среды кислородом) характер величиной окислит-восстановит потенциала. Выражают в единицах rH2. Окислит св-ва средв соответ насыщению среды кислородом rH2=41 В среде с высокими восстановит условиями rH2=0 При равновесии окислит и восстановит процессов: rH2=28. Облигатные анаэробы: живут при rH2<12-14, но размножаются при rH2<3-5 Факультативные анаэробы: развиваются при rH2=0-20-30. Анаэробы: развиваются при rH2=12-15-30. Регулируя окислит-восстановит условия среды, можно затормозит или вызвать активное развитие какой-либо гр микроорг. Характеризует условия протекания в среде окислит и восстановит процессов. В результате взаимод-вия 2х в-в может происходить окислит-восстановит р-ция, приводящая к возникновению между ними разности электрич потенциалов – Еh, или редоксипотенциала. Величина Еh измеряется обычно милливольтами (мВ). Он тем выше, чем больше отношение концентрации компонентов, способных к окислению, к концентрации компонентов, могущих восстанавливаться. Концентрация окисленной формы водорода (Н+) характ величиной рН, концентрация восстановлен формы водорода выражается показателем rH (или rH2), предст собой логарифм величины давления молекулярного водорода, взятый с обратным знаком. Чем меньше величина rH, тем выше восстановит способность среды. Т о, окислит-восстановит св-ва среды могут характ как величиной редоксипотенциала Eh, так и условными единицами rH, указывающими концентрацию молекулярного водорода, способную создать данные окислит-восстановит условия. Чем выше редоксипотенциал, тем выше окислит способность среды и тем выше величина r, т.е. ниже концентрация молекулярного водорода, необходимая для создания окислит-восстановит условий.
Размножение – увелич числа особей. Способы размнож бак: а) деление кл на 2 части (бинарное деление); б) почкование; в) распад нитевидных кл; г) при помощи спор (актиномицеты). Рост – увелич массы в результате синтеза клет материала. Во вр роста бак потребляют питат в-ва, и если объем пит среды не изменяется, то наблюдается ее истощение и прекращение роста. Культивирование (выращивание) бак в такой среде называют периодическим, а культуру – периодической. Если при культивир непрерывно подается свежая пит среда, то такое культивир назыв непрерывным, а культура – непрерывной. Рост периодич культуры на жидкой пит среде разделяют на несколько фаз: I фаза – лаг-фаза – период между посевом и началом размножения; II фаза – фаза логарифмич роста – период интенсивного деления бак и рост кол-ва кл; III фаза – фаза стационарного роста – кол-во кл не меняется и = максимал концентрации (М-концентрация); IV фаза – фаза гибели - снижение кол-ва живых кл; V фаза – фаза уменьш скорости отмирания кл – кл переходят в состояние покоя.
Для культивирования анаэробов необход понизить окислит-восстановит потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. понижен содерж кислорода в среде и окруж ее пространстве. Это достигается применением физ, хим и биологич методов. Физ методы. Основаны на выращивании микроорг в безвоздушной среде, что достигается: 1) посевом в среды, содерж редуцирующие и легко окисляемые в-ва; 2) посевом микроорг в глубину плот пит сред; 3) механич удалением воздуха из сосудов, в кот выращиваются анаэробные микроорг; 4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом. Хим м. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими в-вами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na2S204. Биологич м. Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается 2 агаровых полудиска в 1ой чашке. На 1 сторону агаровой пластинки засевают аэроб, (часто испол S. aureus или Serratia marcescens.) На др сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 сут). В целях сокращения воздуш пространства в чашке пит среду наливают более толстым слоем. Комбинированные м. Основаны на сочетании физ, хим и биологич методов создания анаэробиоза. Среда Китта-Тароцци - жидкая пит среда для культивир анаэробных микроорг, состоящая из мясопептонного бульона, обогащенного экстрактивными продуктами печени животных и содержащего кусочки вываренной печени в кач-тве поглотителя свободного кислорода. Лучшей жидкой пит средой с редуцирующими в-вами явл среда Китта-Тароцци, кот испол с успехом для накопления анаэробов при первич посеве из исслед материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-15 мин для удаления воздуха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла, чтобы предохранить посев от проникновения воздуха. Выросшие анаэробы вызывают помутнения пит среды и образование пузырьков газа. Культивирование – искус выращивание микроорг. Испол для изучения св-в микроорг и для диаг инфекц заб. необходимо: 1) соответств среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимал условия: т, влажность, аэрация (снабжение О2) или создание бескислородных условий для анаэробов; 4) опред вр для выращивания (чаще – 24 ч). Выделение чистой культуры аэробных и анаэробных бак. Чистая культура микроорг – это популяция кл (видимый рост) 1го вида, выросшая на стерил пит среде. Выделение чистой культуры – бактериологич метод. Этот метод явл основным методом диаг бактериал инф. Для получения чистой культуры необход отделить бактериал кл разных видов друг от друга. Чаще всего испол механич способы отделения кл– спец методы посева: а) посев шпателем по Дригальскому в 3 чашки Петри; на 3ей чашке вырастают отдельные колонии; каждая колония – 1 вид, т.к. колония – потомство 1ой кл; б) посев петлей "штрихами" или "сеткой": делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое кол-во микробных кл, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим кол-вом кл вырастут отдельные колонии; Т о, при помощи спец методов посева получают изолированные колонии разных видов бак.