В бактериологич практике уст вида возбуд позволяет поставить диагноз заб, поэтому выделение и идентификация чистой культуры - это и есть бактериологич м диагностики инфекц заб. Постановка этого метода обязательно вкл и опред чувствит выделенной чистой культуры возбуд к а/б (опред антибиотикограммы). Выделение чистой культуры анаэробных бак также осущ в 3 этапа. При этом также получают чистую культуру из 1ой кл и добиваются роста микроорг в виде изолированных колоний с послед ее пересевом и идентификацией. Особен работы по выделению чистой культуры анаэробов явл примен различных методов создания бескислородных условий. 3 этапа: 1ый день. Делают посев (земля, гной) на среду Китта-Тароцци. 2ой день: для получения колоний делают пересев со среды Китта-Тароцци по методу Цейсслера, методу Вейнберга и методу Перетца. 3ий день: колонии пересевают в пробирку с новой средой Китта-Тароцци для накопления чистой культуры; проводят идентификацию чистой культуры анаэробов по морфологич, культурал, тинкториал, биохимич и антиген св-вам. Посев по методу Цейсслера. Каплю (петлю) материала со среды Китта-Тароцци последоват засевают в 3 чашки Петри с кровяным агаром. Посевы ставят в анаэростат или аппарат Аристовского, кот ставят в термостат. На след день на 3ей чашке вырастают отдельные колонии. Делают пересев этих колоний на среду Китта-Тароцци для накопления чистой культуры, изучения ее св-в и точного опред вида микроорг. Посев по методу Вейнберга. Пастеровской пипеткой переносят материал со среды Китта-Тароцци последоват в 3-5 узких пробирок с сахарным МПА, погружая пипетку в расплавленный агар до самого дна пробирки. Пробирки быстро охлаждают под холодной водой. Агар застывает и разобщает микробные кл в глубине агара. Из этих кл вырастают колонии, кот пересевают в новую среду Китта-Тароцци, накапливают чистую культуру и идентифицируют. Выделение чистой культуры проводят в 3 этапа: 1ый этап (1-ый день): а) из материала (смесь бак разных видов) готовят мазок, окраш по Граму и микроскопируют; б) делают посев материала (смеси бак) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37С на 24-48 ч. 2ой э (2-ой д): а) наблюдают посевы и проводят описание колоний разных видов (размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция); б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму (колония должна содержать 1 вид бак); в) делают пересев разных колоний в разные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37С 24 ч. 3ий э (3-ий д): проделывают работу по идентификации (опред вида) культуры и проверяют чистоту культуры. Для опред вида изучают морфологич, культурал, тинкториал и биохимич св-ва: а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА (визуально она характ однородным ростом); б) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; если культура чистая, то обнаруживают одинаковые морфологич и тинкториал кл; в) делают посев на среды Гисса и МПБ для изучения сахаролитич и протеолитич св-в чистой культуры; оставляют в термостате при 37 С на 24 часа.
Пигменты бак – это специфич фоторецепторные молекулы, вторич метаболиты, образующиеся на свету и придающие бак окраску. (Наличие у бак пигментов обычно связано с их способностью существовать за счет энергии света. Некот микроорг утратили способность к фотосинтезу, но сохр пигменты. Способность образовывать пигменты детерминирована генетически и испол в кач-ве диагностич признака. Образование пигментов зависит от состава среды и условий культивирования. У многих микроорг образование пигмента происходит только на свету. Пигменты различают по химич составу и цвету.) Классификация пигментов по растворимости: -жирораствор (каротиноидные, хиноновые, азахиноновые); -водораствор (фенозиновые, пиразиновые) – хромопарные (способны диффундировать в окр среду и окрашивать не только колонии, но и пит среды); -спирторастворимые (каротиноидные, пирроловые); -нерастворимые ни в воде, ни в сильных к-тах (меланиновые).
В зависимости от отношения к растворителям - воде, спирту, эфиру, различают: -пигменты, растворимые в воде (синий пигмент пиоцианин, выделяемый P.aeruginosa -пигменты, растворимые в спирте (красный пигмент - продигиозан, выделяемый В.prodigisum) -пигменты, не растворимые ни в воде, ни в спирте (черный пигмент грибов). Пигменты у микробов играют защитную роль против д-вия солнечного света. Кроме того они участвуют в процессе дыхания. Бак могут образовывать пигменты разного цвета: красный — Serratia marcescens; кремовый — Staphilococcus aureus; желтый — Scifreus; синий — синегнойная палочка Значение пигментов: защита от д-вия видимого света и УФ-лучей; -ассимилируют углекислый газ; -обезвреживают токсич кислородные радикалы; -участвуют в синтезе вит; -обладают антибиотическим д-вием и св-вами биологически активных в-в; -цвет пигмента испол в идентификации бак.
1ой из особенностей ферментов микроорг явл преобладание адаптивных ферментов над конститутивными, что связано как с малым объемом цитоплазмы, так и с их ролью глав механизма адаптации к меняющимся условиям внеш среды. Индуцибельные ферменты синтезируются микробной кл только в ответ на наличие в среде опред субстрата. По их д-вию: - Оксидоредуктазы – энзимы, выступающие кат в различных окислительно-восстановит р-циях, происходящих в кл. В данный класс входит 22 подкласса. - Трансферазы – с 9 подклассами. В него входят энзимы, обеспечивающие р-ции транспорта между разными субстратами, ферменты, принимающие участие в р-циях взаимопревращения в-в, а также обезвреживания различных органич соединений. -Гидролазы – энзимы, разрывающие внутримолекулярные связи субстрата посредством присоед к нему молекул воды. В данном классе 13 подклассов. -Лиазы – в составе находятся только сложн ферменты. В нем 7 подклассов. Энзимы выступают кат в р-циях разрыва С-О, С-С, С-N и прочих типов органич связей. Также ферменты класса лиазы участвуют в обратимых биохимич р-циях отщепления негидролитическим путем. -Изомеразы – энзимы, выступающие кат в хим процессах изомерных превращений, происходящих в 1ой молекуле. к ним относятся сложные ферменты. -Лигазы, иначе именуемые синтетазами – класс, вкл 6 подклассов и предст энзимы, катализирующие процесс соединения 2х молекул под воздействием АТФ. По выделению в окр среду: Ферменты, образуемые бактериал кл, могут локализоваться как внутри кл —эндоферменты, так и выделяться в окр среду — экзоферменты. У микроорг различают также конститутивные и адаптивные ферменты. Конститутивные ферменты постоянно находятся в микробной кл независимо от условий существования. Это в основном ферменты клет обмена: протеазы, липазы, карбогидразы. Адаптивные ферменты синтезируются в кл только под влиянием соответств субстрата, находящегося в пит среде, и когда микроорг вынужден его усваивать. Если бак, не вырабатывающие в обычных условиях фермента амилазы, расщепляющей крахмал, засеять на пит среду, где единственным ист углерода служит крахмал, то они начинают синтезировать этот фермент. Адаптивные ферменты позволяют микробной кл приспособиться к изменившимся условиям существования. Это ферменты: а) пищеварит ферменты, кот расщепляют сложные питат в-ва до простых в-в; б) защитные ферменты, н, пенициллиназа защищает клет стенку от д-вия а\б пенициллина; в) ферменты агрессии – ф-ры вирулентности патогенных бак; - гиалуронидаза–расщепляет гиалурон к-ту; - дезоксирибонуклеаза – расщепляет ДНК кл; - фибринолизин – расщепляет коллаген; - плазмокоагулаза – свертывает плазму крови; - нейраминидаза – расщепляет нейраминовую к-ту; - лецитовителлаза – расщепляет лецитин.
Широкое применение в мед практике ферменты находят в кач-ве диагностич (энзимодиагностика) и терапевтич (энзимотерапия)ср-в. Ферменты также испол в кач-ве специфич реактивов для опред ряда метаболитов. Н, фермент глюкозооксидазу применяют для колич-ного опред глюкозы в моче и крови; фермент уреазу испол для оценки содержания в биологич жидкостях мочевины; с помощью различных дегидрогеназ выявл наличие соответств субстратов, н пирувата, лактата, этилового спирта.
Для опред сахаролитич ферментов испол среды с сахарами: Ø среды Гисса (пестрый ряд): v жидкие – пептонная вода, индикатор Андреде (кислый фуксин), углеводы, спирты; v полужид – пептонная вода, 0,5% агар-агар, индикатор бромкрезол, углеводы, спирты; v короткие – содержащие моносахара и дисахара (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, маннит); v длинные – короткий ряд + моносахара (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза), полисахариды (инулин, крахмал), спирты (глицерин, дульцит, инозит). Ø среда Ресселя – двухсахарный агар (лактоза, глюкоза) и индикатор бромтимоловый синий, Олькеницкого – трехсахарный агар (лактоза, сахароза, глюкоза), индикатор нейтр красный и соль Мора для выявления H2S. Под д-вием сахаролитич ферментов бак углеводы и многоатомные спирты расщепляются до к-ты/к-ты и газа. Для обнаружения газа в жидкие среды помещают поплавки, кот при образовании газа всплывают, а в полужидких – заметно появление пузырьков. Для обнаружения к-ты добавляют индикатор, кот под ее д-вием изменяет цвет. Ø среды Эндо, Левина, Плоскирева – МПА с лактозой и индикаторами – фуксином, метиленовым синим и нейтр красным. У бак, ферментирующих лактозу (лактоза+), колонии окрашиваются в цвет индикатора и приобретают металлич блеск, у лактоза– бак колонии остаются бесцветными. Для опред протеолитических ферментов испол: Ø опред конечных продуктов распада белков (индол, H2S, аммиак); Сероводород, индол и аммиак опред, помещая под пробку пробирки с растущей на МПБ культурой индикатор бумажки: v индол (выделяется при разложении триптофана), окрашивает в розовый цвет индикатор бумажку, пропитанную щавелевой к-той; v H2S (продукт распада серосодержащих аминок-т – цистеина, метионина), реагируя с ацетатом свинца на индикаторной бумажке, превращается в сульфат свинца и окрашивает бумажку в черный цвет; v о наличии аммиака свидетельствует посинение лакмусовой бумажки. Ø способность разжижать желатин (в виде воронки, перевернутой елочки); Ø способность свертывать или пептонизировать плазму крови и молоко.
по отношению к т микроорг делят на 3 основные гр – психрофилы, мезофилы и термофилы. - Психрофилы (криофильные)-микроорг. Имеют минимал т роста около 00С (на несколько градусов ниже), оптимум (растут с максим скоростью) при т не выше 150С. В почвах и водоёмах умеренных широт обитают психротолерантные микроорг, метаболически активные при т до 20- 30С. (фотобак, железобак. Ряд плесеней, некот псевдомонады, флавобак, и даже патогенны, н Clostridium botulinum тип Е). Они адаптированы к пониженным т благодаря след особенностям: Кл психрофиллов содержат ферменты с низкой т активации -Проницаемость мембран регулируется большим кол-вом ненасыщенных жирных к-т, содержащ в липидах - Полисомы образуются и при низких т. - Психротолеранты Охлаждение или замораживание для сохр продуктов питания не обязательно полностью подавляет микробную активность. Возможен рост психротолерантных микроорг с небольшой, но заметной скоростью. Порчу молока, кот хранится после пастеризации при низкой т, вызывают психротолерантные штаммы псевдомонад. - Мезофиллы – растут обычно при т от 0-100 до 40-45С, оптимум 28-30 С. (бол-во сапрофитов, обитатели кишечника и верхних слоёв почвы). - Термофилы – микроорг с минимал скоростью роста обычно выше 50. Опред термофилов менялось в связи с расширением о темп границах жизни и темп оптимумах для отдельных штаммов микроорг. Внутри группы термофилов различают 3 подгр: - Термофильные – растут в диапазоне 40-60 - Экстремальные термофильные микроорг вовсе не растут при т ниже 55, оптимал темп зона роста около 80, максимал 93-105. Выше 75- -гипертермофильные. Бол-во известных сегодня гипертермоф – археи, и лишь немногие – эубак. - Термотолеранты характер максимал т роста, равной 45-48.Термоф бак широко распростр в природе, выделяются из почвы, торфа, ила, воды, компоста, навоза. Широко распростр термофильные сульфатвосстанавл бак, оптимал т роста кот достигает 55-60 С. Причины, обусловливающие способность термофилов существовать при высоких т. Структурные и клет элементы кл (оболочка, мембраны, рибосомы, входящие в состав кл протеины, жиры, ферменты) термофильных микроорг заметно отличаются кач-но и колич-но от подобных клет компонентов мезофильных форм. -Процессы метаболизма в кл термофилов протекают с гораздо большей скоростью, чем в кл мезофилов. Поэтому концентрация кислорода может явиться ф-ром, лимитирующим рост термофильных микроорг. -Устойчивость микробной кл к высокой т зависит от содерж влаги в протоплазме. Чем выше %воды в кл, тем быстрее и при меньшей т наступает гибель.
Стерилизация – это процесс полного уничтожения в объекте всех жизнеспособных форм микробов, в т ч спор. Различают 3 гр методов стерилизации: физ, хим и физикохим. Физ методы: стерилизация высокой т, Уф облучением, ионизирующим облучением, ультразвуком, фильтрованием через стерильные фильтры. Хим м – испол химич в-в, а также газовая стерилизация. Физико-химич м – совместное испол физ и хим методов. Н, высокая т и антисептики. Стерилизация высокой т. К этому методу относятся: 1) стерилизация сухим жаром; 2) стерилизация паром под давлением; 3) стерилизация текучим паром; 4) тиндализация и пастеризация; 5) прокаливание; 6) кипячение.
Дезинфекция – уничтожение патоген микроорг в объектах окр среды для прерывания путей передачи инф с помощью химич в-в. Химич в-ва, кот испол для дезинфекции, назыв дез в-вами. Они нарушают физико-химич структуру микробной кл. По механизму д-вия дез в-ва делят на след гр: 1.Окислители – повреждают сульфгидрильные гр белков. К ним относятся галогены (хлор, бром, йод) и их соед, перекись водорода, перманганат калия. 2. Поверхностно-активные в-ва – повреждают клет стенку. К ним относятся бактерицидные мыла, сульфонол, амфолан, твины. 3. Соли тяжелых металлов – вызывают коагуляцию белков, образование нерастворимых альбуминатов. К ним относятся соли ртути, серебра, меди, свинца. Их применение ограничено при наличии дополнит белков, кот затрудняют доступ к возбуд. 4. Фенол, крезол и их производные – повреждают клет стенку, растворяют липиды цитоплазматич мембраны, нарушая ее полупроницаемость, а затем повреждают белки, вызывая гибель микробов. 5. Щелочи, известь – приводят к набуханию и растворению белков. Их применение ограничено из-за повреждающего д-вия на различные предметы (посуду). 6. Красители – обладают сродством к фосфорнокислым гр, повреждают нуклеопротеиды и вызывают гибель микроорг. К ним относятся бриллиантовый зеленый, метиленовый синий, риванол, трипофлавин. К наиболее распространенным дез в-вам относятся хлорная известь (0,1 –10% р-р), хлорамин (0,5 – 5% р-р), фенол (3-5% р-р). лизол (3-5% р-р). двутретьосновная соль гипохлората кальция (ДТСГК (0,1-10% р-р). 0,1 – 0,2% р-р сулемы и др соед ртути, 70° этиловый спирт. В микробиологич практике дез в-ва испол для обработки посуды (пипетки, предметные стекла), рабочего места, рук. Выбор дез в-ва, длит его воздействия опред особенностями микроорг и той средой, в кот он находится (н, мокрота). Антисептика – испол химич в-в, убивающих или подавляющих размножение различных микроорг на коже и слиз оболочках. В кач-ве антисептиков испол: 70° этиловый спирт, 5% спирт р-р йода, 0,1% р-р марганцевокислого калия, 1-2% р-р метиленового синего или бриллиантового зеленого, 0,5-1% р-р формалина. Понятие антисептики тесно связано с асептикой. Асептика – совокупность мероприятий, предупреждающих попадание микроорг из окр среды в тк, полости орг чела при лечеб и диагностич манипуляциях, в стерильные лп при их изготовлении, а также в материал для исслед, пит среды, культуры микроорг при микробиологич лаб исслед. Для этой цели в бактериологич лаб посевы проводят у пламени спиртовки, предварительно прокаленной петлей, для посева испол стерильные пит среды. Асептика достигается также стерилизацией хирургич инструментов и материалов, обработкой рук хирурга перед операцией, воздуха и предметов операционной, поверхности кожи операционного поля и т.д
Метод основан на бактерицидном д-вии нагретого до 165-170°С воздуха в теч 45 мин. Аппаратура: сухожаровой шкаф (печь Пастера). Печь Пастера – металлич шкаф с двойными стенками, обшитый снаружи материалом, плохо проводящим тепло (асбест). Нагретый воздух циркулирует в пространстве между стенками и выходит наружу через спец отверстия. При работе необход строго следить за нужной т и вр стерилизации. Если т будет более высокой, то произойдет обугливание ватных пробок, бумаги, в кот завернута посуда, а при более низкой т требуется более длит стерилизации. По окончании стерилизации шкаф открывают только после его остывания, иначе стеклян посуда может потрескаться из-за резкой смены т. Материал и режим стерилизации: а) стеклян, металлич, фарфор предметы, посуда, завернутые в бумагу и закрытые ватно-марлевыми пробками для сохр стерильности (165-170°С, 45 мин); б) термостойкие порошкообразные лс - тальк, белая глина, окись цинка (180-200°С, 30-60 мин); в) минерал и растит масла, жиры, ланолин, вазелин, воск (180-200°С, 20- 40 мин).
Наиб эффективный и широко применяемый в микробиологич и клинич практике метод. Метод основан на гидролизующем д-вии пара под давлением на белки микробной кл. Совместное д-вие высокой т и пара обеспечивает высокую эффективность этой стерилизации, при кот погибают самые стойкие спор бак. Аппаратура – автоклав. Автоклав состоит из 2-х металлич цилиндров, вставленных друг в друга с герметически закрывающейся крышкой, завинчивающейся винтами. Наруж котел – водопаровая камера, внутр – стерилизац камера. Имеется манометр, паровыпускной кран, предохранит клапан, водомерное стекло. В верх части стерилизац камеры – отверстие, через кот пар проходит из водопаровой камеры. Манометр служит для опред давления в стерилизацион камере. Между давлением и т существует опред зависимость: 0,5 атм - 112°С, 1-01,1 атм – 119-121°С, 2 атм - 134°С. Предохранит клапан – для защиты от чрезмерного давления. При повыш давления выше заданного, клапан открывается и выпускает лишний пар. Порядок работы. В автоклав наливают воду, ур кот контролируют по водомерному стеклу. В стерилизац камеру помещают материал и плотно завинчивают крышку. Паровыпускной кран открыт. Вкл нагрев. После закипания воды кран закрывают лишь тогда, когда будет вытеснен весь воздух (пар идет непрерывной сильной сухой струей). Если кран закрыть раньше, показания манометра не будут соответст нужной т. После закрытия крана, в котле постепенно повыш давление. Начало стерилиз – тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. По истечении срока стерилизации прекращают нагрев и охлаждают автоклав до возвращения стрелки манометра к 0. Если выпустить пар раньше, жидкость может вскипеть из-за быстрой смены давления и вытолкнуть пробки (стерильность нарушается). Когда стрелка манометра вернется к 0, осторожно открывают паровыпускной кран, спускают пар и затем вынимают стерилиз объекты. Если не выпустить пар после возвращения стрелки к 0, вода может конденсироваться и смочить пробки и стерилиз материал (стерильность нарушится). Материал и режим стерилизации: а) стеклян, металлич, фарфор посуда, белье, резиновые и корковые пробки, изделия из резины, целлюлозы, древесины, перевязочный материал (вата, марля) (119 - 121°С, 20-40 мин)); б) физ р-р, р-ры для инъекций, глазные капли, дистил вода, прост пит среды - МПБ, МПА(119-121°С, 20-40 мин); в) минерал, растит масла в герметически закрытых сосудах (119-121°С, 120 мин);