Лекция: Клеточная инженерия

Влажность в культуральной комнате поддерживается на уровне 60-70%. При недостатке влаги в воздухе подсыхает питательная среда, угнетаются растения in vitro. Влажность в культуральной комнате регулируется автоматически или путем установки сосудов с водой для испарения.

Газовый состав. Наиболее важны для культивирования клеток и тканей содержание в воздухе кислорода и углекислого газа. Содержание кислорода в жидкой питательной среде можно повысить путем встряхивания культуральных сосудов на шейкерах. Содержание кислорода в культуральных сосудах можно регулировать способом их закрывания (металлические крышки дают лучшую аэрацию в сравнении ватно-марлевыми пробками). Жидкая среда при встряхивании снабжается кислородом лучше в сравнении с твердой. Содержание СО₂ в культуральных сосудах достаточно для протекания фотосинтеза, тем более, что углеводы среды являются дополнительным источником углерода.

4. СПЕЦИФИКА КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ

4.1 Получение и культивирование каллуса

Каллус - неорганизованная масса ткани, состоящая из дедифференцированных (утративших специализацию) клеток. Каллусная ткань обычно возникает в местах поранения тканей и является « запасной программой» растения, обеспечивающей защиту раны, накопление необходимых питательных веществ для регенерации утраченного органа (Бутенко, 1990). Каллус может быть получен из эксплантов различного типа (корней, побегов, листьев, пыльцы, эндосперма). Эффективность каллусогенеза зависит от особенностей вида, физиологического состояния растения, типа экспланта и условий его культивирования. Явление каллусогенеза свойственно не только покрытосеменным, но и голосеменным растениям, папоротникам, мхам, печеночникам (Бутенко,1990). Двудольные растения образуют каллус более интенсивно в сравнении с однодольными. Наблюдаются различия между генотипами в способности к каллусогенезу (Рис.1). Молодые ткани более предпочтительны в сравнении со старыми. Размер и форма экспланта не имеют определенного значения. Однако существует минимальный критический размер, уменьшив который, нельзя вызвать рост экспланта (Диксон,1989).

Рис.1. Проявление эффекта гетерозиса по массе каллуса у томата на среде с 6 БАП и НУК (+ - линия 7, >- Тorosa, +- линия 7х Тorosa) (Никонович, Кильчевский, 1995)

Стерилизация экспланта описана в разделе 2. Эксплант после стерилизации помещают на поверхность твердой питательной среды и слегка вдавливают его в агар для обеспечения контакта со средой. Культуральные сосуды - пробирки, чашки Петри, колбы, стеклянные или пластмассовые баночки с завинчивающимися крышками. В качестве питательных сред используют обычно среды Мурасиге-Скуга (МС); Шенка, Хильдебрандта (ШХ), Гамборга (В5) и другие. Оптимальная температура для образования каллуса 22-28 ⁰ С. Каллус может образоваться на свету и в темноте.

Главным условием успешного каллусогенеза являются концентрация и баланс эндогенных и экзогенных ауксинов и цитокининов. Наличие ауксинов вызывает дедифференцировку клеток, то есть утрату специализации и связанных с ней структур и возвращение к состоянию делящейся клетки. Для инициации каллуса обычно используют 2.4-Д и ИУК. При индукции образования каллуса ауксины обычно применяют в концентрациях в 10 раз более высоких, чем та, которая используется для поддержания его роста. Процесс деления дедиффенцированных клеток происходит под действием цитокининов. Отношение ауксинов к цитокининам для получения каллуса до 10:1. Примеры сред и регуляторов роста для получения и роста каллуса у злаков представлены в таблице

Таблица. 2.5

Среды, используемые для получения и роста каллусных культур злаков (Флик, Эванс, Шарп, 1983)*

* Эта ссылка содержит также детальные характеристики использовавшихся эксплантов.

** При добавлении к 4,5 мкМ 2,4-Д.

Образующаяся каллусная ткань не имеет анатомической структуры и может быть разной консистенции: 1) рыхлой, состоящей из сильно оводненных клеток; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; 3) плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы. Рыхлый каллус быстрее растет и используется для получения суспензионной культуры, плотный каллус может применяться для морфогенеза. Цвет каллусной такни может быть белым, желтоватым, зеленым, красноватым, бурым, пигментированным полностью или зонально присутствием хлорофилла и антоцианов (Бутенко, 1990). Клетки каллуса, как и другие клетки проходят три фазы роста (деление, растяжение, дифференцировка), после чего деградируют. Популяция культивируемых клеток каллуса проходит пять фаз развития (рис.2.).

Рис. 2. Модельная кривая ростового цикла при периодическом выращивании каллусных тканей и клеточных культур. Фазы роста: 1 -- лаг-фаза; 2 -- логарифмическая; 3 -- линейная; 4--замедления роста; 5--стационарная.

В течение лаг-фазы не происходит увеличения числа клеток, фаза логарифмического роста отличается наибольшей интенсивностью деления клеток и увеличения массы каллуса, в линейной фазе скорость роста числа клеток постоянна, в фазе замедленного роста уменьшается интенсивность деления, в стационарной фазе число делящихся клеток уравновешивается числом деградировавших, в результате их общее количество не изменяется. После стационарной фазы происходит деградация и отмирание клеток каллуса. Обычно это процесс сопровождается потемнением тканей каллуса. Постепенное старение клеток каллуса обусловлено не только естественной цикличностью в развитии клеток и тканей, но и изменениями, происходящими в составе питательной среды (расходование питательных веществ, повышение концентрации отдельных компонентов в результате испарения воды с поверхности среды, выделение каллусом в состав среды некоторых метаболитов, в том числе токсичных). Все эти причины побуждают переносить часть первичного каллуса на свежую питательную среду через 4-6 недель. Такой прием называется пассированием. Масса переносимого кусочка при культивировании колеблется от 60 до 100 мг ткани на 20-40 мл питательной среды. Ф.Констэбель (1984) рекомендует при субкультивировании первичный каллус, достигший 2-3 см в диаметре, отделять от экспланта и разделять на 4-8 частей для пересадки на свежую питательную среду. Каллусная ткань может пассироваться в течение длительного времени. Так, культура каллусной ткани моркови, полученная Р.Готре более 60 лет назад, поддерживается до сих пор. Поскольку первичный каллус может образоваться из клеток, различных по своей специализации, в процессе длительного пассирования (субкультивирования) образуются штаммы каллусных клеток, имеющие индивидуальные генетические и физиологические особенности.

4.2 Особенности каллусных клеток

Физиолого-биохимические особенности. Образование каллусных клеток часто связано с возникновением раневой поверхности. По мнению Р.Г.Бутенко (1990), между травмами тканей и клеток и образованием каллуса существует причинно-следственная связь, механизм которой неизвестен. Предполагается, что в результате травмы синтезируются биологически активные вещества - индукторы клеточных делений, отличающиеся по своей природе от известных стимуляторов роста : ауксинов, цитокининов, гиббереллинов, Возможно, что эти вещества - продукты разрушения полисахаридов растительной клетки. В результате происходит быстрая дедифференцировка специализированной клетки, метаболизация запасных веществ, перестройка пластидного аппарата, увеличение структур, связанных с синтезом белков, при этом стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ядерной ДНК, исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Таким образом, дедифференцировка клеток каллуса является особым состоянием клетки, при котором изменяется активность генов и белкового аппарата. В остальном клетки каллуса сохраняют физиолого-биохимические особенности организма (устойчивость к абиотическим факторам, способность к синтезу вторичных метаболитов и др.)

В некоторых случаях каллус может образоваться и при отсутствии раневой поверхности. Важной особенностью каллусных клеток при их длительном пассировании является утрата способности к регенерации. Для некоторых культур это наблюдается уже после 4-го пассажа. Обязательным условием деления клеток каллуса является наличие в составе среды ауксинов и цитокининов. При длительном субкультивировании клетки каллуса могут приобрести способность к росту на среде без регуляторов роста. Такая гормононезависимая ткань называется «привыкшей». Природа гормононезависимости, по мнению Р.Г.Бутенко, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормононезависимость). В первом случае гормононезависимость сохраняется при получении растения, во втором случае приобретенная гормононезависимость может исчезать в ряду клетка- растение - клетка. Таким образом, «привыкшие» ткани приобретают способность к синтезу эндогенных ауксинов и цитокининов, что обеспечивает возможность клеточных делений.

Привыкшие ткани имеют много общих черт с опухолевыми тканями, возникающими у растений под воздействием бактерий и вирусов. Наибольший интерес представляют галловые опухоли, индуцируемые агробактериями Agrobacterium tumеfaciens. Как привыкшие, так и опухолевые ткани гормононезависимы и теряют способность к регенерации. Опухолевые ткани могут образовывать тератомы (уродливые органоорганоподобные структуры), не способные к нормальному развитию.

Различия у привыкших и опухолевых тканей заключаются в природе гормононезависимости. У «привыкших» тканей гормононезависимость чаще имеет эпигенетический характер и не наследуется, а у опухолевых тканей такая способность связана с переносом чужеродных генов из бактериальных клеток в растительные (природный трансгеноз).

Генетические особенности. При длительном культивировании в клетках каллуса накапливаются генетические изменения различной природы. Можно выделить несколько типов таких изменений.

1. Полиплоидизация. В результате ряда клеточных делений увеличивается число хромосомных наборов, что приводит к образованию смешанной ткани, состоящей из клеток разного уровня плоидности (миксоплоидов). По сути дела это ткани-химеры.

2. Анеуплоидия. Клетки каллуса in vitro могут терять или приобретать дополнительные хромосомы при субкультивировании. В результате образуется хромосомный набор, некратный основному числу n.

3. Хромосомные аберрации. Потеря отдельных участков хромосом, приводящая к резким изменениям генотипа в культуре in vitro.

4. Генные мутации, которые можно идентифицировать по изменению признаков каллуса и растений-регенерантов.

Все эти типы генетических отклонений можно отнести к сомаклональной изменчивости - увеличению уровня мутирования растительных клеток, выращиваемых в культуре in vitro длительное время.

4.3 Использование каллусных клеток

Сохранение генетического материала. Поддержание биоразнообразия является глобальной задачей всего человечества. Одним из подходов к решению этой проблемы является хранение культуры клеток и тканей с использованием низких температур, в т.ч. в жидком азоте при температуре -196⁰ С. Одним из видов тканей, которые могут сохраняться в таких условиях является каллус, который был использован у моркови, перца, люцерны, риса, кукурузы и других культур. Главные преимущества такого способа - неизменность генотипа, поддерживаемая в течение длительного периода.

Получение суспензионных культур и протопластов. Рыхлый каллус используют для получения одиночных клеток в жидкой питательной среде и последующего культивирования суспензионной культуры, каллусные ткани могут быть также использованы для получения протопластов (клеток, лишенных оболочки)

Использование каллуса в клеточной селекции. Состояние каллуса индуцирует сомаклональную изменчивость, что дает основание для проведения отбора в культуре клеток и создания новых генотипов.