Особенно бурное развитие метод ПЦР получил в связи с программой "Геном ч е- ловека", так как он позволил модифицировать методику секвенирования и ускорить пр о- цесс расшифровки последовательностеи ДНК.
1.Механизм ПЦР.
1.1.Компоненты реакционной смеси.
а. Праймеры - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, состоящие как правило из 15-30 нуклеотидов, комплементарные 3'-концам анализируемых участков ДНК. Они являются начальными участками фрагментов ДНК, подлежащих амплификации. Обычно вводится два праймера, один из которых комплементарен началу одной ц е- пи, другой - концу второй цепи.
б. Смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксирибоаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксирибогуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксириботимидинтрифосфата, (дТТФ) дезоксирибоцитидинтрифосфат (дЦТФ) - являющаяся материалом для синтеза новых цепей.
в. Taq-ДНК-полимераза - термостабильный фермент, выделенный из экстремально термофильной бактерии Thermus aquaticus, обеспечивающий матричный синтез 3'- конца второй цепи ДНК по принципу комплементарности.
г. Реакционный буфер - смесь стабилизаторов, катионов и анионов, обеспечивающий оптимальные условия функционирования полимеразы.
д. Анализируемый образец - препарат ДНК, предположительно содержащий искомую нуклеотидную последовательность, подлежащую амплификации.
1.2.Этапы амплификации
Температурный цикл состоит из трех этапов:
1. Термическая денатурация (плавление цепей).
Анализируемый образец представлен двухцепочечной молекулой ДНК, а для проведения требуются одноцепочечные фрагменты. Для этого реакционная смесь нагревается до 92-95˚С, в результате происходит разрушение водородных связей между нуклеотидами и разделение цепей.
2. Отжиг праймеров.
При снижении температуры до 50-60˚С происходит присоединение праймеров к одноцепочечным фрагментам ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом Ча р- гаффа и принципом комплементарности, то есть если нуклеотидная последовательность праймера комплементарна последовательности анализируемой цепи, то отжиг произойдет, если некомплементарна – нет.
3. Элонгация (синтез цепей).
На этом этапе температура смеси доводится до 72˚С, что является оптимумом для функционирования фермента Taq-ДНК-полимеразы, при этом синтез второй цепи идет с максимальной эффективностью и точностью.
Указанные этапы составляют один температурный цикл. В ходе ПЦР проводится до 30-35 циклов, что позволяет получить из одного участка ДНК до миллиона копий.
81
Важным событием явилось создание приборов-амплификаторов (термоциклеров), которые в автоматическом режиме, по специальной программе, осуществляют высокоточное регулирование температуры реакционной смеси и проводят ПЦР за 3 -5 часов.
После открытия термостабильной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы, обратной транскриптазы) появилась возможность диагностики многих заболеваний, вызываемых РНК-содержащими вирусами (вирус гепатита С, пикорнавирусы, и др.).
2.Области применения ПЦР.
Внастоящее время наиболее быстро развиваются шесть основных направлений ПЦР-диагностики.
1. Диагностика инфекционных заболеваний.
Это связано с тем, что в отличие от ИФА и других методов определения антигенов возбудителя, ДНК-диагностика позволяет непосредственно идентифицировать возбудителя заболевания по его геному.
2. Диагностика онкологических заболеваний.
После открытия онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста и исследований ученых в рамках проекта "Геном человека" появилась возможность определения активности этих генов и, тем самым, указывать на предрасположенность и даже наличие онкологического заболевания у обследуемого субъекта.
3. Диагностика генетических заболеваний.
Внастоящее время разработаны тест-системы диагностики большого количества генетических заболеваний, например, муковисцидоза, миодистрофии Дюшенна-Беккера и др.
4. Идентификация личности.
Определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов является индивидуальной особенностью каждого человека (см. ПДРФ).
5. Определение генетической структуры главного комплекса гистосовместимости
(HLA).
Представляет особую ценность при трансплантации органов и тканей, так как различие в структуре антигенов гистосовместимости, определяемое генетически, лежит в основе реакции отторжения трансплантата.
6. Диагностика патогенов в пище.
Эта отрасль ДНК-диагностики является пока самой скромной среди представленных, однако является перспективной, так как методы являются более точными, быстр ы- ми и информативными.
3.Методы детекции продуктов полимеразной цепной реакции.
Для визуализации результатов амплификации используются различные методы. Наиболее распространенным является электрофорез, основанный на разделении мол е- кул ДНК по подвижности в электрическом поле, которая зависит от их размера.
3.1. Метод горизонтального гель-электрофореза.
82
Образцы вносятся в лунки, сформированные на поверхности пластины геля, приготовленного из 1,5-2,5% агара с добавлением флюоресцентного красителя ДНК - бромистого этидия, который включается в цепь и движется вместе с ней. Пластина помещ а- ется в электрофоретическую камеру, к которой подключен источник постоянного тока. Отрицательно заряженная ДНК движется от отрицательного полюса к положительному. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью и формируют полосу. По окончании электрофореза пластина перекладывается на аппарат, излучающий свет в ультрафиолетовом диапазоне. Энергия излучения поглощается красителем и заставляет его флюоресцировать оранжево-красным светом. По расположению окрашенных полос в исследуемом и контрольном образцах, при известной длине фрагмента, определяют наличие или отсутствие требуемого продукта ПЦР.
3.2. Метод вертикального гель-электрофореза.
Метод схож с предыдущим, но имеет ряд принципиальных отличий. Для провед е- ния анализа используется специальная камера для вертикального электрофореза, в кач е- стве разделяющей среды - специальный полимер (полиакриламид).
Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным и позволяет разделить фрагменты разного размера с точностью до одного нуклеотида. Недостатками метода являются высокая токсичност ь полиакриламида и сложность приготовления геля.
Для обычных исследований не требуется столь высокой точности разделения, п о- этому чаще в диагностических лабораториях применяют метод горизонтального агаро з- ного гель-электрофореза.
Лигазная цепная реакция (ЛЦР).
Лигазы - группа ферментов, катализирующих соединение (лигирование) двух полинуклеотидных цепей за счет гидроксильной группы на 3'-конце одного олигонуклеотида и фосфатной группы на 5'-конце второго олигонуклеотида.
Для процесса сшивания (лигирования) необходимо, чтобы реакционные группы сблизились в пространстве. Эти условия создаются, если оба олигонуклеотида полн о- стью комплементарны соседним участкам тестируемой ДНК. При этом, если хотя бы один нуклеотид, участвующий в лигировании, некомплементарен фрагменту, то сшивания цепей не происходит. Полученные фрагменты детектируются при помощи электрофореза.
Отличия ЛЦР от ПЦР.
1.На одной молекуле-матрице за 30 мин может быть синтезировано до 1 млрд. копий, то есть количественный выход ЛЦР значительно выше.
2.Специфичность ЛЦР в отношении однонуклеотидных замен выше, чем у ПЦР.
3.Высокая скорость протекания реакции имеет значение для проведения экспрессдиагностики, например, при определении степени облучения лиц, подвергшихся радиационному облучению.
83
Рестрикционные методы анализа генома
Рестриктазы - группа бактериальных эндонуклеаз, расщепляющих двойную цепь ДНК в специфических последовательностях нуклеотидов (сайтах рестрикции).
На сегодняшний день известно более 3000 различных рестриктаз, но в исследованиях генома человека используется всего лишь несколько десятков этих ферментов. При обработке геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины, анализируемый электрофоретически.
Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Полимор-
физм длин рестрикционных фрагментов - внутривидовая изменчивость по длине фрагментов геномной ДНК, образующихся после воздействия специфической эндонуклеазой. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованных, как правило, в уникальных последовательностях некодирующих участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генетического кода могут во з- никать и в кодирующих последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающ ие в сайтах узнавания для определённых рестриктаз, делают их устойчивыми к действию этих ферментов.
Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся со специф и- ческими ДНК-зондами.
Анализ ПДРФ включает следующие основные этапы:
1)выделение геномной ДНК;
2)рестрикция выделенной ДНК специфической эндонуклеазой;
3)электрофоретическое разделение образующихся фрагментов;
4)идентификация.
ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае, если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путём проведения ПЦР и рестрикции амплифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в исследуемой области ДНК, размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеазой, тогда как при полном соответствии полиморфной о б- ласти сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины.
Секвенирование
Секвенирование – метод определения нуклеотидной последовательности ДНК. Еще в 50-е годы XX века были разработаны методы секвенирования по амино-
кислотной последовательности белков-ферментов. Недостатком метода явилось, вопервых, то, что распознаванию поддаются только экзоны, так как интроны в ходе процессинга и сплайсинга «вырезаются» и в трансляции участия не принимают. Во -вторых, вследствие вырожденности генетического кода одна аминокислота может кодироваться несколькими кодонами с различной последовательностью нуклеотидов.
В конце 60-х годов прошлого века Ф. Сэнгером были разработаны методы секвенирования РНК, получаемой с ДНК-матрицы при помощи РНК-полимеразы.
84
Первым методом прямого ферментативного секвенирования стал «плюс-минус» метод, разработанный в 1975 году Ф.Сэнгером и Д.Коулсоном. Методика заключается в проведении ограниченной полимеразной реакции в присутствии всех четырех dNTP (один из которых маркирован по альфа-положению фосфата). После проведения очистки от невключившихся дезоксинуклеотидов, смесь разделяют на восемь частей и в «плюс»- системе проводят реакцию в присутствии одного из четырех нуклеотидов, а «минус»- системе – в отсутствии одного из них. Полученные фрагменты разделяют в ПААГ и р е- гистрируют результат. Соответственно в «минус»-системе терминация происходит перед dNTP данного типа, а в «плюс»-системе - после него.
В1976 году А.Максамом и У.Гилбертом был разработан метод химической дегр а- дации ДНК. Исследуемый образец разделяется на четыре аликвоты и в каждую из них вводится реагент, модифицирующий один из dNTP. Последующее выщепление модифицированных нуклеотидов и разделение полученных фрагментов методом гель - электрофореза позволяет установить нуклеотидную последовательность искомого фра г- мента нуклеиновой кислоты.
В1977 году Ф.Сэнгером и Д.Коулсоном был предложен еще один метод, названный ими методом «терминаторов» («дидезокси-метод»). Методика заключается в проведении полимеразной реакции, в которой помимо матрицы и четырех типов dNTP (один из которых радиоактивно меченый по альфа-положению фосфата) вносится один 2’,3’- дидезоксинуклеотид (ddNTP), который способен встраиваться в растущую цепь, но препятствует дальнейшему росту цепи, вследствие отсутствия 3’-ОН-группы. Соответственно терминация роста цепи наступает после включения в нее ddNTP. Постановка реакции в четырех пробирках с четырьмя разными ddNTP, при разделении в ПААГ позволяет расшифровать последовательность нуклеотидов в ДНК.
Внастоящее время широко применяются методы автоматического секвенирования ДНК, основанные на ферментативном секвенировании с использованием терминирующих трансляцию ddNTP. Процесс, как и метод «терминаторов», состоит из двух этапов: проведение терминирующих реакций и разделение полученных фрагментов в п о- лиакриламидном геле. Автоматизированным является только второй этап. Но в отличие от метода Сэнгера-Коулсона, радиоактивно меченый нуклеотид заменен на нуклеотид, несущий флюоресцентную метку. Это значительно удешевляет методику и облегчает процесс детекции результатов.
Несмотря на это, методика анализа достаточно затратна и продолжительна, что не позволяет использовать ее в проведении повседневных анализов и особенно при масс о- вых скрининговых исследованиях.
6.2.Ответить на контрольные вопросы.
7.Вопросы к контролям по данной теме:
7.1. Вопросы, включенные в билеты к курсовому экзамену:
1. Современные методы изучения ДНК. Секвенирование.
85