Материал: Биоиндикация. Микробиологические методы исследования экосистем (90

квадрата окулярной сетки или диаметр поля зрения (прил. 5). Зная сторону квадрата сетки, вычисляют площадь поля зрения s по формуле s = πr2.

Стандартную ошибку определяют точно так же, как указано в п. 1.1.4.

1.2.6. Анализ и обобщение полученных результатов

На основании полученных результатов по определению общей численности бактериобентоса и численности сапротрофных бактерий определяют класс качества исследуемых ДО, пользуясь справочным материалом (прил. 7). Результаты, полученные всеми рабочими звеньями, заносят в итоговую таблицу (табл. 5).

Таблица 5

Итоговая таблица по обследованному объекту

Полученные данные сопоставляют с результатами анализа проб воды. На основании комплекса проведенных исследований делают обобщенный вывод о состоянии водоема и процессах самоочищения.

21

Тема2.Оценка состояния почв

Практически все виды человеческой деятельности сопровождаются нарушением состояния окружающей среды, в том числе и почв. Основные нарушения почвенного покрова связаны с физическим, химическим и биологическим видами антропогенного воздействия. При процессах трансформации загрязняющих веществ в ходе самоочищения в почве могут образовываться не только безвредные вещества, но и еще более токсичные соединения, нежели попавшие в нее. Существенным может оказаться и комбинированное действие токсикантов, причем вещества могут вести себя и как синергисты, и как антагонисты. Изменения, происходящие в почве под влиянием различного рода загрязнений, могут повлечь за собой потерю почвенного плодородия и приобретение токсических для живых организмов свойств.

Все виды воздействий в первую очередь сказываются на микронаселении почв как наиболее чувствительном и быстро реагирующем компоненте любой экосистемы. Большинство загрязнителей влияют на численность, видовой состав и жизнедеятельность почвенной микробиоты. Они ингибируют процессы минерализации и синтеза различных веществ в почве, подавляют дыхание почвенных микроорганизмов, вызывают микробостатический эффект. Наиболее изученной к настоящему времени является реакция на загрязнение бактерий и микроскопических грибов, поэтому их чаще всего используют в качестве биоиндикаторов при мониторинге почв.

2.1. Лабораторнаяработа3

Оценка качества почв с помощью бактерий

рода Azotobacter

Одним из индикаторов состояния почв является присутствие в них азотфиксирующих бактерий, уровень жизнедеятельности которых служит объективным показателем плодородия почвы. Свободноживущие азотфиксаторы рода Azotobacter предпочитают гумусированные почвы с нейтральной реакцией среды, богатые доступными соединениями фосфора и достаточным количеством органического вещества и влаги. Химическое загрязнение

22

ведет к снижению плодородия почв и, следовательно, к снижению численности и даже полному исчезновению бактерий этого рода. В связи с этим бактерии рода Azotobacter традиционно применяются как индикаторы химического загрязнения почвы.

В данной работе используется метод оценки биологической токсичности почвы по некоторым параметрам роста бактерий рода Azotobacter: их численности, среднему диаметру колоний и коэффициенту влияния (КВ) [10, 15]. К достоинствам метода относятся простота и доступность, кроме того, он позволяет быстро дать ориентировочную оценку биологической токсичности исследуемых субстратов.

Цель работы – оценка биологической токсичности почв по некоторым показателям роста бактерий р. Azotobacter.

Задачи:

1. Определить численность бактерий р. Azotobacter в исследуемых образцах почв.

2. Определить средний диаметр колоний бактерий р. Azotobacter, выросших в посевах из разных образцов почв.

3.Рассчитать коэффициент влияния для исследуемых образцов почв.

4.На основании проведенных исследований оценить качество исследуемых почв и распределить их по мере возрастания токсичности.

Каждое звено студентов (3–4 человека) анализирует отдельный образец почвы, среди которых один образец – контрольный. Для выполнения данной работы отводится два занятия. На первом занятии студенты делают все необходимые посевы (п. 2.1.1 и 2.1.2). На следующем – обрабатывают результаты посевов: проводят подсчет численности бактерий р. Azotobacter, определяют средний диаметр колоний, рассчитывают коэффициент влияния, делают вывод о качестве исследованных почв (п. 2.1.3–2.1.5).

Порядок выполнения лабораторной работы

2.1.1. Приготовление почвенной суспензии и разведений

Для количественного учета бактерий р. Azotobacter применяют посев на твердую питательную среду из предварительно приготовленной почвенной суспензии. Поступают следующим образом.

23

Исследуемую почву помещают на часовое стекло, предварительно стерилизованное горящим спиртом. Стерильным пинцетом удаляют камни и растительные остатки. После этого взвешивают на технических весах 10 г почвы и переносят ее в стерильную ступку.

Для диспергирования почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с поверхности почвенных частиц почву подвергают специальной обработке. Берут две стерильные колбы емкостью 250 мл: одну со 100 мл водопроводной воды, другую − пустую. Подготовленную навеску почвы увлажняют до пастообразного состояния небольшим количеством стерильной воды из первой колбы и растирают 5 мин стерильным резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке, соблюдая все правила работы в стерильных условиях.

Полученную кашицеобразную почвенную массу количественно переносят в пустую стерильную колбу, многократно смывая остатки почвы со стенок ступки стерильной водой из первой колбы. Затем колбу с почвенной суспензией ставят на качалку и встряхивают в течение 10 мин. После этого суспензии дают отстояться 15 мин, чтобы осели крупные частицы, и сразу же используют для приготовления разведений (рис. 5).

Рис. 5. Приготовление разведений почвенного образца

При этом учитывают, что в полученной суспензии почва разведена в 10 раз (10:100 или 1:10). Последующие разведения готовят так же, как описано в п. 1.1.1.

24

2.1.2. Посев на питательную среду

для количественного учета бактерий рода Azotobacter

Для определения численности бактерий рода Azotobacter производят посев в чашки Петри на среду Эшби. Стерильные чашки заливают расплавленной и охлажденной до 45о С средой, слегка приоткрывая крышки. Расход среды на каждую чашку около 10–15 мл. Дают среде застыть, после чего стерильной пипеткой вносят 0,1–0,2 мл жидкости на поверхность твердой среды в середину чашки и растирают каплю стерильным шпателем Дригальского. Следует работать очень аккуратно, чтобы не повредить поверхность среды. Посевы делают из каждого разведения в двух повторностях. Чашки с посевами инкубируют в термостате 5–7 суток при 28о С.

2.1.3. Анализ выросших колоний

На среде Эшби бактерии рода Azotobacter растут в виде плоских слизистых колоний пастообразной консистенции. Характерно также пигментирование, колонии представителей рода могут быть окрашены в тёмно-коричневый, зелёный и другие цвета или же могут быть бесцветными в зависимости от видовой принадлежности.

Проводят микроскопирование нескольких таких колоний, для чего готовят препараты-мазки (прил. 2, 3).

Клетки бактерий рода Azotobacter относительно крупные (1– 2 мкм в диаметре), обычно овальные, но обладают плеоморфизмом, то есть могут иметь разную форму – от палочковидной до сферической. На микроскопических препаратах клетки могут располагаться одиночно, парами, неправильными скоплениями или, изредка, цепочками различной длины. Грамотрицательные. Формируют особые покоящиеся формы – цисты, не образуют спор. В свежих культурах клетки подвижны за счёт многочисленных жгутиков. В более поздних культурах клетки теряют подвижность, приобретают почти кокковидную форму и продуцируют толстый слой слизи, формирующий капсулу клетки.

Подсчет типичных колоний и определение численности бактерий рода Azotobacter проводят точно так же, как определение численности копиотрофов при анализе проб воды. Результаты подсчета колоний заносят в таблицу, аналогичную табл. 1 (см.

25