Материал: Вашков В.И. Антимикробные средства и методы дезинфекции при инфекционных заболеваниях

турой кишечной палочки и стафилококка - в течение 6- 7 дней, а с культурой антракоида - в течение 14 дней.

Окончательное суждение о наличии у испытуемого веще­

ства бактерицидных и спорицидных свойств вынося·т по­ сле обобщения результатов 3 повторных опытов.

Определение бактериостатическоrо действия. При

оценке антим·икробных свойств дезинфицирующего сред­

ства разграничивают бактерицидное действие препарата

от бактериостатическоrо. Если для изучаемого вещества

известен нейтрализатор, то промывка пересеваемого ма­

териала в растворе нейтрализатора достаточна для устранения бактериостатических свойств дезинфицирую­

щего вещества.

Бактериостатическое действие препарата устанавли­

вают также путем добавки в питательные среды веществ,

адсорбирующих дезинфицирующие препараты (10% ин­ акт~mированная сыворотка и др.).

В тех случаях, когда нейтрализатор неизвестен, при изучении нового дезинфектанта применяют отмывание

микроорганизмов от остатков исследуемого вещества пу­

тем центрифугирования. Для этого 3 мл взвеси бакте­ риальной культуры и исследуемого раствора в соотноше­ нии 1 : 9 после определенной экспозиции помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение

5 мин при 3000 об/мин. Удаляют надосадочную жид­

кость, остаток ресуспендируют в 3 мл физиологического раствора и вновь центрифугируют в течение 5 мин. По­ следнюю процедуру повторяют трижды. Остаток засева­

ют на питательные среды.

Кроме культуральных методов исследования, бакте­

риологическое действие устанавливают при использова­

нии биологической пробы на животных. Биологическую пробу для определения бактериостатических свойств ис­

пользуют только в опытах с патогенными ·культурами

кишечной группы - В. typhi, В. typhi murium, предвари­

тельно оттитровав вирулентность штаммов, а спороста­

.тическую - с патогенной культурой сибиреязвенной па­

лочки. При этом бактериальную или споровую культу­

ру, подвергнутую воздействию исследуемого препарата,

освобождают от последнего путем центрифугирования,

как описано выше, и вводят восприимчивому животно­

му. Количество вводимых микробных тел должно соот­

ветствовать вирулентной дозе. Все эксперименты повто­

ряют не менее 3 раз.

55

Особенно строго поддерживают температуру иссле­

дуемого раствора (20 °С). Небольшие колебания темпе­

ратуры растворов обусловливают значительную разницу

в результатах. Во всех опытах 'Используют питательные

среды, приготовленные только по одному рецепту.

Определение зависимости эффективности дезинфици­

рующих средств от различных факторов. После установ­

ления бактерицидных свойств дезинфицирующего веще­ ства изучают зависимость его эффективности от концент­

рации действующего начала, времени воздействия, тем­ пературы, реакции среды, наличия белковой защиты путем воздействия дезинфицирующих растворов на бакте­ рии, фю<сированные на батистовых тест-объектах.

Влияние указанных факторов на эффективность обез­ зараживания определяют в опытах с батистовыми тест­

объектами, зараженными по такой же методике, как и

при изучении устойчивости.

Для изучения влияния белка на бактерицидную ак­

тивность дезинфицирующего средства ба1'истовые тес­

ты заражают 18-24-часовой бульонной культурой ки­ шечной палочки или стафилококка. Бульонную культуру перед использованием встряхивают (она содержит 1 млрд. микробных тел в 1 мл, если сделан посев О, 1 мл

24-часовой бульонной культуры .в 10 мл бульона). При использовании агаровых культур во взвесь бактерий до­ бавляют в качестве белковой защиты 20% инактивиро­ ванной сыворотки или дефибринированной крови. Инак­

тивацию нормальной сыворотки крупного рогатого скота проводят дробным трехкратным прогревом на водяной

бане при температуре 50-60 °С в течение 30 мин. При

испытании бактерицидной активности препарата в при­ сутствии белка пользуются теми концентрациями, кото­ рые оказались эффек1'ивными при обеззараживании тест­ объектов, зараженных опытными культурами без бел­

ковой защиты. Если активность препарата не снижае1'Ся в присутствии белка, концентрацию последнего увеличи­ вают до 40 %. Отсутствие снижения активности препара­ та и при добавлении 40% белка свидетельствует, что данный препарат не реагирует с белком.

Влияние температуры на активность исследуемого

дезинфицирующего средства изучают при обеззаражива­

нии инфицированных батистовых тест-объектов. Для это­ го колбу с исследуемым раствором помещают в водяную баню. Доводят температуру исследуемого раствора до

56

желаемого уровня и опускают зараженные тест-объекты.

Далее порядок проведения опыта такой же, как и при

исследовании устойчивости тест-культур.

Влияние рН среды изучают также при обеззаражива­

нии инфицированных батистовых тест-объектов. Готовят

ряд разведений исследуемого вещества с различными

рН. Для подкисления используют децинормальный рас­

твор соляной или другой ~ислоты, а для подщелачива­ ния - децинормальный раствор щелочи. Порядок прове­ дения опыта такой же, как при изучении устойчивости

тест-культур.

Определение активности средств при обеззаражива­

нии поверхностей. Изучение антимикробной активности

дезинфцдирующих средств при обеззараживании по­

верхностей проводится с целью разра,бо11ки режима обез­

зараживания их в зависимости от концентрации раство­

ра, кратности обработ,ки, расхода жидкости на 1 м2 по­

верхности, экспозиции, температуры, вида поверхности.

В качестве тест-объектов используют поверхности размером lOXlO см из 1разл,ичных материалов: деревян­

ные, оштукатуренные, окрашенные масляной или клее­

вой краской, оклеенные обояrми, покрытые линолеумом и др. Перед нанесением культуры тест-поверхности под­

вергают механической очистке - моют водой с мылом и

щеткой, за исключением поверхностей, оклеенных обоя­ ми и окрашенных клеевой краской. Последние протирают

несколь·ко раз стерильной салфеткой, увлажненной сте­ рильной водопроводной водой. После подсыхания по­

верхности располагают горизонтально и на них пипет­

кой наносят 2-миллиардную взвесь из расчета 0,5 мл на

100 см2• Культуру равномерно распределяют по поверх­

ности стеклянным шпателем, подсушивают при комнат­

ной температуре (18-20°С) и относительной влажности

воздуха 50-60%. Культуру наносят на поверхность на­

кануне опыта.

При обеззараживании поверхности оштукатуренные,

окрашенные клеевой краской, оклеенные обоями, а так­

же кафель обрабатывают только в вер11икальном поло­

жении, остальные - как в горизонтальном, так и в вер­

тикальном. Дезинфицирующий раствор наносят на по­

верхность путем орошения из пульверизатора, следя за

количеством израсходованной жидкости. Максимальная норма расхода дезинфицирующего раствора не должна

превышать 300-500 мл/м2• После орошения поверхности

57

uстанлнют до полного высыхания. В контрольных опы­

тах аналогично заршкенныс поверхности орошают сте­

рильной водопроводной водой из того же расчета, что

иподопытные.

Контроль эффект,ивности дезинфекции осуществляют следующим образом. Забирают пробы с контрольных и

подопытных поверхностей путем тщательного протира­

ния их стерильным, слегка увлажненным тампоном или

стерильной марлевой салфеткой (5Х5 см). После про­ тирания на поверхности не должно оставаться излишней

влаги. Ватный тампон или марлевую салфетку отмывают

в 10 мл нейтрализатора или в стерильной водопроводной

воде с бусами в течение 10 мин. Отмывную жидкость с подопытных поверхностей вносят в чашки Петри (обыч­

но в 2-3 чашки по 0,5-1 мл в каждую), заливают рас­ топленным и остуженным до 40-50 °С агаром. Жид­

кость с контрольных поверхностей перед посевом разво­ дят в 100 раз. Для равномерного распределения микроор­ ганизмов в агаре последний перемешивают круговыми движениями до застывания питательной среды.

После выдерживания посевов в термостате при 37 °С

подсчитывают количество колоний, выросших на чашках

Петри, определяют плотность заражения на 100 см2 и

процент обеззараживания, принимая количество бакте­

рий, снятых с контрольных тест-объектов, за 100%. На­ пример, с 100 м2 ~<;онтрольной поверхности снято 148 ООО· микробных тел, а· с аналогичного вида подопытной по­

верхности - 20 микробных тел.

= 0,013% выживших микроорганизмов.

0-гсюда следует, что процент обеззараживания опыт­

ной поверхности составляет 99,987. Окончательную оцен­

ку обеззараживания поверхностей дают на основании 3

повторных опытов с совпадающими результатами.

Эффективным считают такое средство, которое при обеззараживании поверхностей обеспечивает гибель 99,99% рабочего штамма на подопытных поверхностях.

При работе с гладкими поверхностями забор проб по­ сле обеззараживания производят не только путем смы­

вов, но и методом отпечатков, который заключается в

следующем. На дно чашек Петри помещают равного

58

диаметра марлевый кружочек. С двух сторон по ,краю

марлевого ·кружочка при выкраивании оставляют «сте­

бельки» - полоски марли длиной 2-3 см, ,которые вы­ ступают за края чашки Петри. Для того чтобы марля при

стерилизации не свертывалась, на нее помещают листок

фильw.овальной бумаги. Чашки стерилизуют вместе с марлей и фильтровальной бумагой. После стерилизации

из чашек стерильным пинцетом вынимают фильтроваль­

ную бумагу, а в чашки на марлю выливают расплавлен­

ный и остывший до 40-50 °С мясо-пептонный или казеи­ новый агар, или агар Энда. После подсыхания питатель­

ной среды без нарушения целостности и стерильности

агаровой пластинки ее вынимают, беря за «стебельки», и

накладывают на исследуемую поверхность для получе­

ния отпечатков. Затем агар, взяв за «стебельки», поме­ щают обратно в ту же чашку Петри и ставят в термо­ стат. Таких отпечатков делают с одной и той же поверх­

ности не менее трех. Выращивание посевов и подсчет ко­

лоний проводят так же, как и при методе смывов. Определение активности средств при обеззаражива­

нии белья. Активность дезинфицирующих средств при обеззараживании белья устанавливают с целью разра­

ботки эффективных режимов обеззараживания его в за­

висимости от концентрации действующего начала, вре­

мени обработки. При этом учитывают также норму рас­

хода дезинфицирующего раствора на 1 кг белья, темпе­ ратуру раствора, степень и характер загрязнения белья, влияние дезинфицирующего раствора на прочность и ок­

раску белья. Контроль эффективности обеззараживания белья дезинфицирующими средствами проводят с по­ мощью тест-объектов, представляющих собой кусочю1

бязи размером 2Х2 см. Бязь предварительно обрабаты­

вают так же, :как батист (см. стр. 51).

Заражение стерильных тест-объектов из бязи произ­

водят 2-миллиардной бактериальной или споровой

взвесью тест-культур из расчета 20 мл на 10 тест-объек­

тов. Обсемененные культурой и подсушенные в термо­

стате тест-объекты закладывают в бязевые мешочки

(размером 5Х8 см) по два в каждый. Мешочки закры­

вают в виде конверта, к углу его прикрепляют нитку

длиной около 0,5 м.

Дез·инфицирующий раствор готовят перед опытом из расчета 4 л на 1 кг белья при работе с вегетативными

формамп микроорганизмов и 5 л - в опытах со спорами

59