Материал: Practicum_po_microbiologii

Результаты реакции оценивают в плюсах по следующей схеме:

(++++) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная;

(+++) - гемолиз 25% эритроцитов;

(++) - гемолиз 50% эритроцитов;

(+) - гемолиз 75% эритроцитов;

(-) - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Степень задержки гемолиза эритроцитов определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость из них сливают в одну. Из этой жидкости готовят разведения с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:

Таблица 17

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в пробирках шкалы, процент гемолиза выражают в плюсах.

Диагностическая оценка. При исследовании сывороток в одной пробирке (в разведении 1:5 с антигеном) все сыворотки, давшие задержку гемолиза на один плюс и выше, исследуют повторно в тот же или на другой день в трех пробирках в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена.

Реакцию считают положительной при задержке на два-четыре плюса в одном или двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полным гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена); сомнительной — при задержке гемолиза с оценкой один плюс. При получении сомнительного результата сыворотки крови от животных через 15-20 дней исследуют повторно. При этом животных, с сывороткой крови которых получена дважды сомнительная реакция, считают реагирующими положительно.

Реакция длительного связывания комплемента (РСДК)

Эту реакцию, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез, туберкулез, кампилобактериоз.

Основные принципы постановки РДСК от РСК мало чем отличаются друг от друга.

Особенность этой реакции заключается в том, что при постановке главного опыта бактериолитическую систему выдерживают при трех температурных режимах: 1) при комнатной температуре 15 мин; 2) при 4°С в холодильнике – 18-20 ч; 3) на водяной бане 37-38°С -15 мин.

После добавления компонентов, входящих в гемолитическую систему, пробирки с реакцией помещают в водяную баню при 37-38°С на 10 мин.

Результаты РДСК учитывают точно так же, как и при РСК.

Задания для самостоятельной работы (для трех занятий)

Первое занятие по РСК

1. Провести учет реакции агглютинации классическим (пробирочным) методом на бруцеллез с сыворотками крови крупного рогатого скота.

2. Усвоить сущность РСК и ознакомиться с ее компонентами.

3. Ознакомиться с результатами проверки компонентов на антикомплементарность и гемотоксичность.

4. Ознакомиться с результатами титрования гемолитической сыворотки.

Второе занятие

Провести постановку и учет результатов титрования комплемента в бактериолитической системе.

Третье занятие

Провести постановку и учет главного опыта реакции связывания комплемента.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. При проверке компонентов на антикомплементарность и гемотоксичность взяты: комплемент (1:20), гемолизин в рабочем титре, эритроциты барана (2,5%-ная взвесь), физраствор. Определить результат реакции.

А. Полный гемолиз.

Б. Отсутствие гемолиза.

2. При проверке компонентов на антикомплементарность и гемотоксичность взяты: комплемент (1:20), эритроциты барана (2,5%-ная взвесь), физраствор. Определить результат реакции.

А. Полный гемолиз.

Б. Отсутствие гемолиза.

3. При постановке главного опыта РСК на бруцеллез с исследуемыми сыворотками крупного рогатого скота получены результаты: с пробой №1 – полный гемолиз: с пробой №2 – нет гемолиза. Дайте диагностическую оценку реакции.

А. Положительная.

Б. Отрицательная.

4. При титровании гемолизина получены результаты: 1:1000 – ПГ; 1:1200 – ПГ; 1:1500-ПГ; 1:2000 – ЧГ; 1:2500 – ЧГ; 1:3000 – ЧГ. Указать титр гемолизина;

А. 1:1000. Г. 1:2000.

Б. 1:1200. Д. 1:2500.

В. 1:1500. Е. 1:3000.

5. При титровании гемолизина установлен его предельный титр 1:2000. Определить рабочий титр гемолизина.

А. 1:1000. Г. 1:2000.

Б. 1:1200. Д. 1:2500.

В. 1:1500.

6. При титровании комплемента в гемолитической системе получены результаты: 0,02 мл – НГ; 0,04 – НГ; 0,06 – ЧГ; 0,08 – ЧГ; 0,10 – ПГ; 0,12 – ПГ. Указать титр комплемента.

А. 0,02.

Б. 0,04.

В. 0,06.

Г. 0,08.

Д. 0,10.

Е. 0,12.

Обозначения:

НГ - нет гемолиза.

ЧГ - частичный гемолиз.

ПГ - полный гемолиз.

7. При постановке РСК на бруцеллез с сывороткой крови больного животного допущена неточность: в пробирку внесено комплемента больше, чем установлено при титровании. К каким результатам может привести эта оплошность?

А. Полный гемолиз.

Б. Частичный гемолиз.

В. Отсутствие гемолиза.

8. При постановке РСК на бруцеллез с сывороткой крови здорового животного допущена неточность: в пробирку внесено комплемента меньше, чем установлено при титровании. К каким результатам может привести эта оплошность?

А. Полный гемолиз.

Б. Частичный гемолиз.

В. Отсутствие гемолиза.

9. При постановке РСК на бруцеллез с сывороткой крови здорового животного допущена неточность: в пробирку внесено гемолизина больше, чем установлено при титровании. К каким результатам может привести эта неточность?

А. Полный гемолиз.

Б. Частичный гемолиз.

В. Отсутствие гемолиза.

10. При постановке РСК на бруцеллез с сывороткой крови больного животного допущена неточность: в пробирку внесено гемолизина меньше, чем установлено при титровании. К каким результатам может привести эта неточность?

А. Полный гемолиз.

Б. Частичный гемолиз.

В. Отсутствие гемолиза.

11. При постановке РСК на бруцеллез с сывороткой крови здорового животного допущена неточность: в пробирку внесено гемолизина меньше, чем установлено при титровании. К каким результатам может привести эта неточность?

А. Полный гемолиз.

Б. Частичный гемолиз.

В. Отсутствие гемолиза.

12. При постановке РСК на бруцеллез с сывороткой крови больного животного была допущена неточность: в пробирку внесено гемолизина больше, чем установлено при титровании, К каким результатам может привести эта неточность?

А. Полный гемолиз.

Б. Частичный гемолиз.

В. Отсутствие гемолиза.

Тема 24. Методы люминесцентной микроскопии

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Дать общее представление о люминесцентной микроскопии. Ознакомиться с техникой обработки препаратов для микроскопии различными флюорохромами. Освоить методы и приемы проведения реакции иммунофлюоресценции с использованием меченых антител.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Предметные стекла, исследуемый материал (бактериальная культура, патологический материал), соответствующая флюоресцирующая сыворотка, физиологический раствор или фосфатный буфер с рН 7,2-7,4 для промывания мазков, влажная камера (чашки Петри с увлажненной ватой), фильтровальная бумага, нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат, люминесцентный микроскоп или люминесцентный осветитель (любой марки), размещенные в затемненной комнате с активной вентиляцией.

Среди методов диагностики бактериальных и вирусных инфекций особое место занимает люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия. Повышенная чувствительность, цветное изображение на темном нефлюоресцирующем фоне, возможность обнаружения микроорганизмов, простота и надежность флюорохромирования – ценные качества этого вида микроскопии.

Особое значение люминесцентная микроскопия имеет при экспресс-диагностике инфекционных болезней, при экспресс-индикации возбудителя во внешней среде. Результаты люминесцентной микроскопии являются довольно специфичными и высоко точными. По данным ряда авторов, этот метод не уступает по показателям данным биопробы и другим методам, однако для люминесцентной микроскопии нужно иметь высококачественные специфические флюоресцирующие сыворотки и специальные краски – флюорохромы. Люминесцентная микроскопия в последние годы находит все большее применение. Так, диагностика инфекционных болезней классическим методом биопробы осуществляется в пределах от 5-9 до 30 суток, а люминесцентным методом достигается в точение 30 минут до 5-6 часов, т.е. во много раз быстрее, чем классическим методом биопробы.

Первый люминесцентный микроскоп был предложен австрийскими учеными Келером и Зидентонфом в 1908 г. Большой вклад в дело создания люминесцентных микроскопов внес академик С.И. Вавилов и его школа.

Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения и красителей светиться под воздействием падающего на них света. Молекулы веществ, способных к люминесценции, поглощают энергию падающего на них света и переходят в возбужденное состояние, которое характеризуется более высоким энергетическим уровнем. В таком состоянии они находятся непродолжительное время и вновь возвращаются к исходному энергетическому уровню. Этот период сопровождается отдачей избытка энергии в виде света – люминесценцией. Как правило, для возбуждения люминесценции объект освещают ультрафиолетовыми лучами длиной волны 300-400 нм или сине-фиолетовыми лучами длиной волны 400-460 нм.