Материал: Practicum_po_microbiologii

Рис. 52. Батометр – аппарат для взятия проб воды из открытых источников

Определение коли-титра (КТ) и коли-индекса (КИ) воды

Коли-титром воды называют наименьший ее объем, в котором обнаружены бактерии группы кишечной палочки (БГКП).

Коли-индекс показывает число БГКП в 1 литре воды.

Показатель БГКП указывает на санитарное состояние воды, пригодной в качестве питьевой. Это показатель калового загрязнения воды, так как эти бактерии попадают в воду с калом животных и человека. При большом содержании БГКП в воде создается потенциальная угроза попадания в нее и патогенных бактерий, которые могут вызвать у человека и животных инфекционные болезни.

Определение БГКП осуществляется двумя методами:

1. Метод бродильных проб.

2. Метод мембранных фильтров.

Метод бродильных проб

Этот метод основан на определении сахаролитической активности БГКП. Исследуемая вода в определенных объемах засевается на глюкозо-пептонную среду (ГПС) или лактозо-пептонную среду (ЛПС) с поплавками и индикатором.

Водопроводную воду для определения КТ засевают в объеме 333 мл (три объема по 100 мл, три – по 10 мл и три объема по 1 мл) во флаконы (колбы). При этом вода в объемах 100 и 10 мл засевается во флаконы и пробирки с 10 и 1 мл концентрированной среды, а 1 мл – в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации.

Сточные воды для исследования засевают в объемах: 1; 0,1; 0,01 и 0,001 в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации.

Посевы инкубируют в термостате 24 часа при 37°С.

При отсутствии БГКП образование кислоты и газа не происходит (помутнение может быть).

Рост БГКП сопровождается помутнением, образованием газа и изменением цвета среды (красный цвет переходит в желтый). Из подозрительных флаконов и пробирок на БГКП проводят посев на агар Эндо. Посевы инкубируют при 37°С 24 часа. При отсутствии роста на агаре Эндо или при наличии колоний, не характерных для БГКП,дается отрицательный ответ.

Из колоний, характерных для бактерий БГКП (ярко-красные с металлическим оттенком), готовят мазки с окраской по Граму. Изучают культуру по оксидазному тесту – фильтровальную бумагу смачивают раствором нафтола-диэтил-фенилендиамина и на нее наносят штрихом снятые 2-3 колонии с агара Эндо.

Для кишечной палочки характерно: наличие грамотрицательных палочек в препарате (мазке) и отсутствие изменений в окраске индикаторной бумажки (отрицательная реакция на оксидазу).

Бактериологические показатели для питьевой (водопроводной воды, подвергнутой очистке и дезинфекции):

- общее микробное число – не более 100;

- коли-титр – не менее 300;

- коли-индекс не должен превышать 3.

Вода артезианских скважин должна соответствовать следующим нормам: общее микробное число – не более 100, коли-титр – не менее 500, коли-индекс – не более 2.

Вода открытых водоемов считается доброкачественной, если общее микробное число – не более 1000, коли-титр – не менее 111, коли-индекс – не более 9.

Метод мембранных фильтров

Определение коли-индекса воды проводят методом концентрации бактерий из определенного ее количества на мембранных фильтрах и с последующим их наложением на плотные питательные среды. На поверхности фильтра вырастают колонии, которые поддаются количественному учету.

Мембранные фильтры изготовляют из нитроцеллюлозы с различными по размеру порами.

Для исследования воды используют фильтр № 3, который на своей поверхности задерживает БГКП.

Перед началом работы мембранные фильтры стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 10-15 мин.

Фильтр осторожно матовой поверхностью вверх накладывают на сетку фильтрационного прибора типа Зейтца, который предварительно должен быть простерилизован фламбированием.

В воронку наливают нужное количество воды и в приемной колбе создается вакуум при помощи водоструйного или другого насоса. Исследуемая вода просачивается через пластинку мембранного фильтра, а бактерии, находящиеся в ней, остаются на поверхности фильтра. По окончании фильтрации верхнюю часть прибора снимают, мембранный фильтр матовой стороной вверх переносят стерильным пинцетом на поверхность агара Эндо в чашках. Чашки крышками вниз помещают в термостат при 37°С на 18-24 ч.

Через поры мембранного фильтра происходит диффузия растворимых частей среды Эндо; вследствие этого на поверхности фильтра вырастают типичные колонии для БГКП — ярко-красные с металлическим оттенком.

По числу выросших колоний определяют количество кишечных палочек в 1 л воды и тем самым устанавливают коли-индекс.

Водопроводная вода исследуется в количестве 333 мл, т.е. она пропускается последовательно через четыре фильтра в объемах 3, 30, 100 и 200 мл.

Установление наличия в воде патогенных бактерий осуществляется путем посева на дифференциально-диагностические и элективные питательные среды с последующей их идентификацией методами, принятыми в микробиологии.

Задание для самостоятельной работы

1. Провести отбор проб воды из водопроводной сети и определить общее микробное число водопроводной и речной воды.

2. Определить коли-титр водопроводной воды методом бродильных проб и коли-индекс речной воды методом мембранных фильтров.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Правила взятия воды для санитарно-бактериологического исследований.

2. Как проводится определение общего микробного числа в воде?

3. Что такое коли-титр, коли-индекс воды, какова методика их определения?

4. Оценка санитарно-бактериологического качества воды по ГОСТу.

Тема 19. Подведение итогов санитарно-микробиологического исследования воздуха, почвы и воды (19.1). Санитарно-микробиологическое исследование мяса (19.2)

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Ознакомить с методами количественного учета общего микробного числа в исследуемых объектах.

Провести учет выросших колоний после посева из воздуха, почвы и воды, определить коли-титр и коли-индекс воды. Обобщить данные по санитарно-микробиологической оценке исследуемых объектов

Ознакомить с методами санитарно-микробиологического исследования мяса.

Освоить метод бактериоскопического исследования мяса на свежесть.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Посевы, сделанные на предыдущих занятиях для определения общего микробного числа в воздухе, почве и в воде. Для подсчета колоний – трафареты, счетные камеры. Таблицы для расчета коли-титра и коли-индекса. Предметные стекла, краски по Граму, спиртовки, пинцеты, скальпели, пробы мяса различной свежести.

19.1. Методы количественного определения микробов в исследуемых объектах

Одним из способов определения общего микробного числа в исследуемых объектах является метод посева определенного объема или навески такого материала на плотные питательные среды. После культивирования посевов приступают к подсчету выросших колоний, по количеству которых судят о степени загрязненности исследуемых объектов.

Количественному учету подлежат все колонии, независимо от их величины, окраски, формы и т.п., принимая каждую колонию за одну бактериальную клетку.

В зависимости от количества выросших колоний при подсчете их поступают различно. Если их число при ориентировочной оценке не превышает 50, то прибегают к фронтальному (сплошному) подсчету. Для этого, повернув чашку вверх дном, при помощи лупы, считают все колонии, отмечая каждую сосчитанную колонию чернилами или восковым карандашом на дне чашки.

Для подсчета колоний при большом их количестве применяют метод выборочного подсчета, пользуясь специальными приемами.

1. Со стороны дна площадь чашки делят восковым карандашом на равное число секторов (на 4, или 6, или 8). Число колоний подсчитывают в одном из секторов. Полученное количество колоний умножают на число секторов. Таким образом вычисляют общее количество колоний, выросших на всей площади чашки.

2. Тем или иным приемом определяют среднее число колоний, которое выросло на площади 1 см². Предварительно вычисляют площадь чашки по формуле S=πR². Стандартная чашка имеет радиус 5 см, следовательно, ее площадь равна 3,14 х 25 = 78 см² .

Среднее число колоний, выросших на площади 1 см², умножают на площадь чашки. Полученное число выражает общее количество колоний, которое выросло на всей поверхности чашки.

а) использование трафарета (шаблона).

Со стороны дна чашки накладывают трафарет, который имеет пять окон, площадь каждого из них составляет 1 см². Подсчет колоний осуществляется в пяти окнах, после чего общее количество колоний делят на пять, получая среднее число колоний, выросших на площади в 1 см².

б) использование счетной камеры.

Она представляет собой стеклянную пластинку, укрепленную на деревянной подставке. Пластинка разделена на 144 квадрата, каждый из которых равен 1 см²; квадраты, расположенные по диагонали, в свою очередь разделены на 9 малых квадратов каждый.

Для подсчета колоний чашку помещают под стеклянную пластинку вверх дном и подсчитывают число колоний в 10 квадратах (еcли колоний много, считают в малых квадратах). Определив среднее число колоний на 1 см² среды, умножают это число на площадь всей чашки и таким образом вычисляют число колоний на всей поверхности среды.

в) использование аппарата для подсчета колоний.

Принцип подсчета в этом случае остается таким же, как и в счетной камере. Вместе с тем аппарат имеет дополнительные приспособления, позволяющие ускорить подсчет колоний. Для этого он имеет стационарную лупу, подсветку со сменными светофильтрами, авторучку с датчиком; одновременно с отметкой колоний количество их фиксируется на счетчике (рис. 53).

Рис. 53. Аппарат для подсчета колоний бактерий: 1 – столик для чашки Петри; 2 – маркер с датчиком; 3 – счетчик; 4 – тумблер для включения импульсного счетчика; 5 – тумблер для включения подсветки

При обработке данных по определению количества бактерий в исследуемых объектах принимают во внимание следующие положении;

1. Оценивают только те разведения, при посеве которых выросло на чашках от 30 до 300 колоний.

2. Полученные результаты округляют: