Материал: Practicum_po_microbiologii

Тема 25. Иммуноферментный метод (ифм) диагностики инфекционных болезней

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Дать общее представление о сущности иммуноферментного метода. Ознакомить с компонентами и оборудованием для проведения этого метода. Провести определение антигена с помощью ИФМ.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ для выполнения твердофазного иммуноферментного метода. Иммунологический планшет, специфические сыворотка или иммуноглобулины, термостат, фосфатный буфер рН 7,2-7,4 с твин-20, специфический антиген (для контроля – неспецифический антиген), шприц-дозатор, пероксидазный антивидовой конъюгат (антивидовая меченая сыворотка), субстратная смесь (индикатор ортофенилдиамин с 3%-ным раствором перекиси водорода).

Иммуноферментный метод основан на взаимодействии антигена и антитела, где в качестве метки в конъюгате (комплекс антитела или антигена с ферментом) используется фермент пероксидаза или другая соответствующая к ним субстратная смесь (5-аминосалициловая кислота и перекись водорода или ортафенилендиамин и перекись водорода). По чувствительности этот метод в 100 и более раз превышает РНГА, РДП и др. Предел чувствительности иммуноферментного метода достигает 1-10 нг/мл специфического белка.

Иммуноферментный метод используется для выявления и идентификации микроорганизмов и антител к ним. Различают две разновидности иммуноферментного метода: гомогенный и гетерогенный.

Гетерогенный (в литературе он описан под названием иммуносорбентного - ELISA-теста и РЭМА - реакции энзиммеченых антител (или антигенов), адсорбированных на поверхности водонерастворимых полимеразных материалов. При гомогенном иммуноферментном методе не используется твердая фаза.

Гомогенный иммуноферментный метод в основном используется для определения низкомолекулярных антигенов (гормонов, лекарственных препаратов).

Основные компоненты, необходимые для выполнения твердофазного иммуноферментного метода:

1. Специфические иммуноглобулины (выделяются из гипериммунной сыворотки осаждением сульфатом аммония с последующей очисткой).

2. Антивидовые глобулины (выделяются из антивидовых сывороток осаждением сульфатом аммония с последующей очисткой).

3. Белок А (выделяют из золотистого стафилококка) или бычий сывороточный альбумин.

4. Антиген (готовят из органов зараженных животных). Заведомо положительные или отрицательные антигены.

5. Фермент пероксидаза (выделяют из хрена).

6. Конъюгаты (пероксидаза, связанная с антителами или антигеном методом периодатного окисления).

7. Субстратная смесь (5-аминосалициловая кислота и перекись водорода или ортофенилендиамин и перекись водорода).

8. Детергент (поверхностноактивные вещества: твин-20, 80, трилон Х-100, сорбиталь с-20).

9. Иммунологический планшет (планшет из прозрачного полистирола).

10. Шприц-дозатор (для разлива ингредиентов реакции).

На биофабриках и в лабораториях научно-исследовательских институтов готовят диагностические наборы.

Существуют прямой и непрямой методы постановки этой реакции. На практике в основном используется непрямой метод.

Методика постановки иммуноферментного метода для определения антигена.

Перед постановкой реакции лиофилизированные компоненты растворяют в объеме, указанном на этикетке 0,01 М раствором фосфатного буфера или дистиллированной водой и доводят до объема рабочих разведений. Объем каждого из компонентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, составляет 0,1 мл.

Этапы постановки реакции (рис. 70):

1. Сенсибилизация планшета. В лунки планшета вносят специфические антитела (иммуноглобулины) в рабочем разведении, указанном на этикетке.

Планшет с антителами инкубируют в термостате при 37°С 3 часа или при 4°С 18 часов. По окончании инкубации проводят отмывку планшета раствором фосфатного буфера, содержащим твин, 3-4 раза, предварительно встряхнув содержимое лунок. Остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.

2. Внесение антигенов. В лунки планшета, сенсибилизированные специфическими антителами, вносят контрольные положительный и отрицательный антигены и исследуемую пробу в разведениях от 1:10 до 1:1280 и инкубируют в термостате при 37°С 1 час. По истечении срока инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от несвязавшихся с антителом антигенов и подсушивают на фильтровальной бумаге.

3. Внесение пероксидазного антивидового конъюгата в разведении с целью выявления комплекса антиген+антитело. Залитые планшеты помещают в термостат при 37°С на 1 час. Затем лунки планшета трехкратно отмывают с раствором ФБТ и подсушивают.

4. Внесение субстратной смеси. Для проявления реакции в лунки планшета вносят раствор субстрата (индикатора пероксидазы) – ортофенилдиамина, к раствору которого добавляют 3%-ный раствор перекиси водорода для выявления комплекса антиген+антитело+конъюгат. Планшеты закрывают и оставляют в темном месте при комнатной температуре на 15-30 мин.

5. Учет реакции проводят визуально или спектрофотометрически.

Твердый субстрат (пластиковый микропланшет)

Рис. 70. Схема выявления антигена иммуноферментным методом.

Последовательность внесения компонентов:

1. Фиксация специфических антител на твердом субстрате.

2. Исследуемый антиген в разведениях.

3. Меченая ферментом антивидовая сыворотка.

4. Субстратная смесь (3%-ный раствор перекиси водорода с индикатором).

Положительная реакция: изменение цвета индикатора (оранжевое окрашивание).

При визуальной оценке реакции учет проводят по четырехплюсовой системе:

++++ - интенсивное окрашивание;

+++ - оранжевое окрашивание:

++ - бледно-оранжевое окрашивание;

+ - желтое окрашивание.

Пробу считают положительной при оценке в два плюса и более. За титр антигена принимают наивысшее разведение, при котором в реакции со специфическим антителом наблюдается бледно-оранжевое окрашивание (2+), значительно превосходящее по интенсивности окрашивание контрольных лунок планшета.

При спектрофотометрическом учете результатов реакции производят расчет коэффициента специфичности, который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным: антигеном (ОП₁) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОП₂). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности не ниже 2,1, и отрицательной, если ниже 2,1.

Техника постановки иммуноферментного метода для обнаружения (или титрования) антител выполняется так же, как при обнаружении и идентификации микробного антигена, с той разницей, что материалом является исследуемая сыворотка крови.

Задания для самостоятельной работы

1. Используя твердофазный иммуноферментный метод, провести определение вида антигена с диагностической целью.

2. Провести учет полученных результатов.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Какова сущность иммуноферментного метода и его отличие от других серологических реакций?

2. Какие компоненты участвуют в этой реакции и требования, предъявляемые к ним?

3. Техника постановки иммуноферментного метода и учет полученных результатов.

4. С какой целью используют иммуноферментный метод в микробиологии?

Тема 26. Использование в микробиологии полимеразной цепной реакции (пцр)

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Освоить сущность полимеразной цепной реакции, ознакомиться с компонентами и методом ее постановки.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Набор компонентов для постановки ПЦР, приборы - амплификатор, аппарат для электрофореза, трансиллюминатор.

ПЦР, разработанная в последние годы, находит все большее использование в микробиологии. С помощью этой реакции можно быстро и надежно провести диагностику инфекционных болезней животных и человека путем индикации возбудителя в исследуемом материале на генетическом уровне.

Вначале из патологического материала или микробной культуры методом щелочного гидролиза выделяют ДНК-образца. С ДНК-образца проводят полимеразную цепную реакцию, т.е. амплификацию заданного фрагмента ДНК-гена. При этом происходит образование дополнительных копий гена в пробирке заданного участка ДНК-образца. Для этого в пробирку с ДНК-образца вносят основные компоненты: праймер (затравку), трифосфаты, ДНК-полимеразу. Праймер представляет собой олигонуклеотид, состоящий из 15-20 нуклеотидов. Его получают путем химического синтеза на автоматическом синтезаторе «Виктория», пользуясь данными о первичной структуре (нуклеотидной последовательности) ДНК определенного вида микроорганизма.

Смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (dGTR, dATP, dCTP, dTTP) – дезоксигуанин, - аденин, цитозин, тимин, трифосфорная кислота. ДНК-полимераза - фермент, способный использовать полинуклеотиды как матрицы и строить комплиментарные им новые нуклеотидные цепи.

Пробирки помещают в амплификатор-прибор, который позволяет поддерживать строго заданный температурный режим, и осуществлять полимеразную цепную реакцию.

Сущность ПЦР заключается в том, что молекулу ДНК подвергают температурному плавлению, то есть нагреванию до 90-94°С, что ведет к денатурации – разрушению водородных связей между азотистыми основаниями двойной спирали, а затем охлаждают (отжиг) до 52°С в присутствии праймера, фермента ДНК-полимеразы и всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов. Последующее повышение температуры до 70-72°С приводит к синтезу новой молекулы ДНК, комплементарной матричной. Эту процедуру (плавления, отжига и синтеза ДНК) повторяют многократно, в результате чего количество выбранного фрагмента ДНК увеличивается.