Материал: Practicum_po_microbiologii

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сыворотки вносят по 0,2 мл антигена в рабочем разведении, а во второй ряд – по 0,2 мл физраствора. Пробирки помещают в водяную баню при 37-38°С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл гемолитической системы, встряхивают их, вновь ставят в водяную баню при 37-38°С на 20 мин.

Для приготовления гемолитической системы берется гемолитическая сыворотка в рабочем титре и эритроциты барана в разведении 1:40 в равных частях.

После водяной бани учитывается результат.

Титром гемолизина считают наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза в течение 10 мин при 37-38°С 0,2 мл взвеси эритроцитов в присутствии 0,2 мл комплемента, разведенного 1:20. В приведенной таблице титр гемолизина равен 1:1500. Рабочий титр гемолизина для РСК должен быть в два раза выше. Так, если титр гемолизина равен 1:1500, то рабочий титр в РСК будет 1:750.

Титрование комплемента в гемолитической системе

Комплемент титруют в разведении 1:20 в дозах от 0,02 до 0,2 мл с интервалами в дозах по 0,02 мл. После внесения комплемента в каждую пробирку добавляют недостающее до 0,2 мл количество физиологического раствора и остальные компоненты по схеме, как указано в таблице 13.

Титром комплемента в гемолитической системе считают наименьшее его количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в течение 10 мин в водяной бане при 37-38°С. В примере, приведенном в таблице, титр комплемента в гемолитической системе равен 0,08.

Схема титрования комплемента в гемолитической системе

Таблица 13

Компоненты	Номера пробирок
Компоненты	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Комплемент (1:20)	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,20
Физиологический раствор	0,18	0,16	0,14	0,12	0,10	0,08	0,06	0,04	0,02	-
Гемолизин в удвоенном титре	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
2,5%-ная взвесь эритроцитов барана	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 10 мин при 37-38^С
Примерный результат	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ

3. Титрирование комплемента в бактериолитической системе (таблица 14)

Перед постановкой главного опыта РСК проводят титрование комплемента в бактериолитической системе с позитивной (бруцеллезной) сывороткой, негативной сывороткой крови того вида животных, которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии. Каждую сыворотку разводят 1:5 физраствором (1 мл сыворотки+4 мл физраствора) и инактивируют.

Сыворотку разливают по 0,2 мл в два ряда, в каждой из которых по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (в разведении 1:20) в возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой пробирке) количество физраствора.

Точно так же по такой же схеме проводят титрование комплемента в бактериолитической системе с использованием позитивной и одной из исследуемых сывороток. Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное его количество в разведении 1:20, вызывающее полный гемолиз взвеси эритроцитов в разведении 1:40 в пробирках с негативной и исследуемой сыворотками с антигеном и без антигена, а также в пробирках с позитивной сывороткой без антигена в течение 20 мин в водяной бане при 37-38С, при задержке гемолиза в пробирках с бруцеллезной сывороткой и антигеном. Определение титра комплемента в бактериолитической системе проводят согласно схеме.

В приведенном примере титр комплемента в этой системе равен 0,10 мл. рабочий титр комплемента для главного опыта на 0,02 мл больше, в данном случае 0,12 мл.

Таблица 14

Схема титрования комплемента в бактериологической системе

Компоненты	Ряд пробирок	Номера пробирок
Компоненты	Ряд пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Негативная сыворотка 1:5	1	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Негативная сыворотка 1:5	2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Антиген в рабочем титр	1	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Антиген в рабочем титр	2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Физраствор	1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Физраствор	2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Комплемент в разведении 1:20	1	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,20
Комплемент в разведении 1:20	2	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,20
Недостающее количество физраствора	1	0,18	0,16	0,14	0,12	0,10	0,08	0,06	0,04	0,02	-
Недостающее количество физраствора	2	0,18	0,16	0,14	0,12	0,10	0,08	0,06	0,04	0,02	-
Водяная баня 20 мин при 37-38^С
Гемолитическая система	1	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Гемолитическая система	2	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 20 мин при 37-38^С
Примерный результат	1	НГ	НГ	ЧГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ
Примерный результат	2	НГ	НГ	ЧГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ

Обозначения: ПГ – полный гемолиз; ЧГ – частичный гемолиз; НГ – нет гемолиза

Таблица 15

Схема определения титра комплемента

Сыворотки	Ряды пробирок	Номера пробирок и дозы комплемента, мл
Сыворотки	Ряды пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Позитивная	1	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++
	2	++++	++	+	+	-	-	-	-	-	-
Негативная	1	++++	++	+	+	-	-	-	-	-	-
	2	+++	++	+	-	-	-	-	-	-	-
Исследуемая	1	++++	++++	+++	+++	++	+	+	-	-	-
	2	++++	+++	+	+	-	-	-	-	-	-

Расчет количества неразведенного комплемента, необходимого для главного опыта, делают по формуле

х = АВ : 20,

где х – количество неразведенного комплемента; А – рабочий титр комплемента; В – количество пробирок в опыте; 20 – основное разведение комплемента (3:20).

Пример: х = (0,12 • 100) : 20 = 0,6. Так как количество комплемента в рабочем разведении, требующееся для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 20 мл (0,2 – 100), то к 0,6 мл неразведенного комплемента следует добавить 19,4 мл физраствора.

Главный опыт рск

При массовых исследованиях реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при повторном исследовании в разведениях одной сыворотки 1:5 без антигена и 1:5 и 1:10 с антигеном.

При исследовании в одной пробирке берут 0,04 мл исследуемой сыворотки и добавляют 0,4 мл физраствора (разведение 1:5).

При постановке реакции в трех пробирках в первую наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки и добавляют 0,4 мл физраствора (разведение 1:5). Из первой пробирки 0,2 мл переносят во вторую и 0,1 мл - в третью, в которую затем добавляют 0,1 мл физраствора (разведение 1:10).

Реакцию ставят по схеме главного опыта (табл. 16). Главный опыт сопровождается следующими контролями:

- негативная и бруцеллезная сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме главного опыта);

- гемолитическая система (0,6 мл физраствора и 0,4 мл гемолитической системы).

Учет результатов РСК проводят визуально. При постановке реакций в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани; при исследовании в трех пробирках - через 3-4 ч, когда в контрольных пробах с позитивной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (пробирки с реакцией хранят в холодильнике).

Таблица 16

Схема главного опыта РСК

Компоненты	При массовом исследовании		для повторного исследования
	пробирки с исследуемыми сыворотками	контроль гемолитической системы	Пробирки для каждой исследуемой сыворотки			контроль гемолитической системы
	пробирки с исследуемыми сыворотками	контроль гемолитической системы	1	2	3	контроль гемолитической системы
Исследуемая сыворотка	0,04	-	0,04	0,04	0,02	-
Физраствор	0,16	0,6	0,36	0,16	0,18	0,6
Инактирование сывороток
Антиген в рабочем титре	0,2	-	-	0,2	0,2	-
Комплемент в рабочем разведении	0,2	-	0,2	0,2	0,2	-
Водяная баня 20 мин при 37-38С
Гемолитическая система	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 20 мин при 37-38С

Источник: https://files.student-it.ru/previewfile/279395

Смотрите также:



17. Введение 18. Линейные программы 19. Ветвления 20. Программирование циклических алгоритмов
Сборные железобетонные ребристые плиты перекрытия
_-___-~1
_3 тема - Диффузия
_Роджерс Карл, Брак и его альтернативы
_Штерн Вильям, Дифференциальная психология и ее методические основы
- Описание типа СЭТ7009
- Программа ГПИ